D5囊胚解冻后培养时间对妊娠结局的影响

刘军霞，熊顺，韩伟，武丽红，黄国宁

(重庆市妇幼保健院生殖医学中心，人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆 400013)

囊胚移植提高了种植率、妊娠率及活产率，同时降低了流产率[1-2]。随着玻璃化冷冻的普及以及囊胚培养的优化，玻璃化冷冻囊胚开始广泛应用，国内外许多中心开展了玻璃化冻融囊胚移植。由于每个生殖中心工作模式的不同，囊胚解冻的时间也不同。有的是提前解冻过夜培养后移植，有的是解冻后当天移植。囊胚解冻后体外培养时间对移植结局的影响尚存在争议，有报道认为解冻后培养时间对囊胚移植结局无影响[2-3]，有报道则认为解冻后培养时间对囊胚的移植结局有影响[4-7]。鉴于此，本研究对我中心的D5冻融囊胚移植周期数据进行回顾性分析，分析囊胚解冻后培养时间对妊娠结局的影响，期望可以优化囊胚解冻移植策略，更好的指导临床工作。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析我中心2018年7月至2019年12月行冻融囊胚移植的病例资料。

纳入标准：年龄小于38岁；复苏周期采用人工周期准备内膜；冻融的囊胚为D5的4期优质囊胚。排除标准：子宫内膜异位症及子宫腺肌症；内膜<8 mm；移植次数>2次的患者。

共纳入1 571个周期。根据解冻后培养时间分为A组(培养2～4 h)和B组(过夜培养16～20 h)。考虑到移植囊胚数目对妊娠结局的影响，根据移植囊胚数目进一步将以上两组再各分为两个亚组：移植2枚囊胚的A2组(n=459)和B2组(n=658)；移植1枚囊胚的A1组(n=218)和B1组(n=236)。

二、研究方法

1.囊胚培养及评分：本研究纳入的患者在新鲜周期中所采用的超促排卵方案按照本中心常规进行，受精方式采用常规IVF或ICSI授精。胚胎培养使用G5序贯培养液(Vitrolife，瑞典)，置于37℃、6% CO2、5% O2培养箱培养。囊胚培养使用G2培养液(Vitrolife，瑞典)，第5天和第6天分别观察囊胚形成情况。囊胚评分参考Gardner评分系统。本实验室将内细胞团与滋养外胚层的评分为BB及以上的囊胚定义为优质囊胚。因囊胚发育阶段及质量会对妊娠结局产生重要的影响，故本研究纳入的冷冻囊胚标准为第5天形成的评级在BB级及以上的4期优质囊胚。

2.囊胚冷冻及复苏：采用玻璃化冷冻/复苏试剂盒(Kitazato，日本)。囊胚冷冻之前均使用激光打孔进行人工皱缩。冷冻前在室温下(24～ 25℃)平衡30 min；将囊胚在ES液中平衡10 min，再移入VS液中洗涤约60 s，迅速将囊胚置于开放式冷冻载杆(Cryotop，日本)上，立即投入液氮。囊胚复苏操作前，将TS液于37℃条件下平衡1 h，DS、WS1、WS2液均于室温下(24～25℃)平衡30 min；将装载冷冻囊胚载杆从液氮罐中取出，迅速放入TS液中1 min，使囊胚脱落，然后将囊胚依次置于DS液3 min，WS1、WS2液中各5 min。解冻后的囊胚行激光辅助孵化。过夜培养16～20 h或培养2～4 h后进行移植。

3.子宫内膜的准备与囊胚移植：于月经周期第2～4天开始口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜尔，德国)4～10 mg/d，14 d后再次B超检查子宫内膜厚度，当内膜厚度≥7 mm时，加用黄体酮(雪诺同，默克雪兰诺，德国)90 mg，黄体酮转化的第6天行囊胚移植。

4.移植后妊娠判定及观察指标：移植后14 d 测血β-HCG值。移植后4～6周，B超检查见宫内或宫外孕囊定义为临床妊娠，孕囊数即着床个数。

观察指标：着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%(单胚胎移植孕囊数仅计为1)；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%；继续妊娠率=继续妊娠周期数/移植周期数×100%；多胎率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者基础情况比较

本研究纳入1 571个D5囊胚冻融移植周期。患者的年龄范围为20～37 岁。患者的年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础性激素水平、内膜厚度及原发不孕的比例在双囊胚移植周期(A2组 vs. B2组)、单囊胚移植周期(A1组 vs. B1组)比较均无统计学差异(P>0.05)(表1，表2)。

表1 双囊胚移植患者的一般情况比较[(-±s)，n(%)]

表2 单囊胚移植患者的一般情况比较[(-±s)，n(%)]

二、各组的临床结局比较

A2和B2及A1和B1组间囊胚复苏率无统计学差异(P>0.05)；A2组的种植率、临床妊娠率、继续妊娠率和多胎率显著高于B2组(P<0.05)，而流产率显著低于B2组(P<0.05)；A1组的种植率、临床妊娠率和继续妊娠率显著高于B1组(P<0.05)，A1组的流产率有降低的趋势，但无统计学差异(P>0.05)(表3，表4)。

表3 双囊胚移植的临床结局比较(%)

表4 单囊胚移植的临床结局比较(%)

三、Logistic回归分析

Logistic回归分析显示，囊胚解冻后是否过夜培养及移植囊胚数与妊娠率有显著相关性(P<0.05)，过夜培养与妊娠率呈负相关，移植囊胚数与妊娠率呈正相关；其它因素与妊娠率无显著性相关性(P>0.05)(表5)。囊胚解冻后是否过夜培养与流产率有显著相关性(P<0.05)，过夜培养与流产率呈正相关；其它因素与流产率无显著性相关性(P>0.05)(表6)。

表5 临床妊娠率影响因素的Logistic回归分析

表6 流产率影响因素的Logistic回归分析

讨 论

冻融囊胚移植的妊娠结局跟囊胚的发育速度及囊胚质量密切相关[8-10]，考虑到囊胚发育速度及质量对妊娠结局的影响，本研究纳入的囊胚均为D5冷冻的4期优质囊胚。各组患者的一般情况在移植双囊胚组间及移植单囊胚组间均无统计学差异，各组间的复苏率也无统计学差异(P>0.05)。

本研究的Logistic回归分析显示：囊胚解冻后是否过夜培养及移植囊胚数与临床妊娠率有显著相关性(P<0.05)，过夜培养与妊娠率呈负相关，移植囊胚数与妊娠率呈正相关；囊胚解冻后是否过夜培养与流产率有显著相关性(P<0.05)，过夜培养与流产率呈正相关。研究结果显示，囊胚解冻后培养时间2～4 h组移植的临床妊娠率、种植率及继续妊娠率显著高于培养16～20 h组，而流产率低于16～20 h组，改善了妊娠结局。

Fang等[2]研究显示囊胚解冻后过夜培养和当天解冻培养2～3 h的临床妊娠率、种植率及继续妊娠率无统计学差异(P>0.05)。周静等[6]的研究显示解冻后过夜培养16～18 h与解冻培养2～4 h的妊娠率及种植率无统计学差异(P>0.05)。本研究结果与这些研究结果不同，可能是因为文献中的囊胚不是选择的D5优质囊胚，没有平衡囊胚的发育速度及质量，而且文献中内膜准备方案也与本研究不同，这些可能造成了与本研究结果的差异。还有一些关于囊胚解冻后体外培养时间对妊娠结局影响的研究，是对比了当天解冻后不同培养时间对妊娠结局的影响。如陶林林等[5]的报道显示囊胚解冻后培养2～5 h比≤2 h提高了临床妊娠率。邱乒乒等[4]的研究显示囊胚解冻后培养4～8 h较培养2～4 h改善了临床结局。这些结果显示延长囊胚解冻后培养时间改善了临床结局，可能是适当延长培养时间后淘汰了发育差的囊胚，选择出更有活力的囊胚[11]。同时由于解冻与移植仍然在同一天进行，并未影响到囊胚与内膜的同步性。但是本研究中囊胚提前解冻过夜培养16～20 h移植，体外培养时间较长，增加了囊胚损伤的可能性[12]，同时囊胚经过过夜培养后与内膜的同步性是否受到影响还尚未可知。这些原因可能造成本研究结果与上述两个当天解冻后移植的研究结果不同。本研究中双囊胚移植周期中解冻后2～4 h组的流产率显著低于过夜培养组，单囊胚移植的流产率组间无统计学差异，但是有降低趋势。有报道显示囊胚解冻后过夜培养比培养2～4 h移植的流产率增加[6-7]，本研究结果与其一致。有文献报道D6囊胚在体外延长1 d培养，促凋亡基因BAX表达增加，增加了细胞凋亡的发生率[13]。过夜培养可能会增加囊胚损伤的可能性[12]，从而增加流产率。结果提示囊胚解冻后体外培养时间不宜过长，以免影响妊娠结局。

本研究中解冻后培养2～4 h移植，双囊胚移植组的多胎率显著高于16～20 h组(54.96% vs.39.48%，P<0.05)，单囊胚移植组的多胎率均低于2%，与文献报道的数据一致，单囊胚移植明显降低了多胎率[14-16]。因此在临床工作中，考虑到多胎对母亲和胎儿的影响，应该尽量降低多胎率，推荐单囊胚移植。

D5囊胚当天解冻培养2～4 h移植的优势：D5囊胚解冻后培养2～4 h移植，减少了体外培养时间，降低了囊胚损伤的可能性[12]；D5囊胚复苏后培养2～4 h移植与内膜的同步性较好，从而提高了妊娠率及着床率，降低了流产率。另外有文献报道在移植整倍体囊胚中，D5囊胚的种植率和活产率较高[9]。2019年的一篇荟萃分析对D5和D6的冷冻囊胚移植妊娠率及出生率进行分析，D5的囊胚妊娠率和出生率高于D6的囊胚[17]。这些研究也显示了D5囊胚移植的优势，提示应该避免将D5囊胚解冻后过夜培养成为D6的囊胚再进行移植。

本研究中Logistic回归分析显示：囊胚移植数与临床妊娠率有显著相关性(P<0.05)，且与妊娠率呈正相关。本研究对移植囊胚数进行匹配，使结果更加客观准确；纳入的数据为D5的4期优质囊胚，排除了囊胚发育速度及质量对妊娠结局的影响；均采用人工周期准备内膜，排除方案对种植窗的影响；而且排除了高龄、反复种植失败及本身有内膜因素的患者。通过这些纳入条件的限制，减少了各种混杂因素的干扰，使结果更加客观。由于本研究是回顾性研究，研究结果仍可能会存在一定的偏倚，需要大样本前瞻性对照研究来进一步验证。研究只对人工周期内膜准备方案的患者进行分析，所以不一定适用于其它内膜准备方案的患者。

综上所述，D5冷冻囊胚解冻后培养2～4 h移植比培养16～20 h移植的妊娠结局更好，建议解冻后培养时间不宜过长，尽可能合理安排囊胚解冻时间，改善患者的妊娠结局。