多囊卵巢综合征患者HMGA2基因多态性与胰岛素抵抗的相关性研究

王景娜，魏蕊霞，贾君

(中国人民解放军联勤保障部队第980医院妇产科，石家庄 050000)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期女性最常见的生殖内分泌疾病，以高雄激素血症、卵巢多囊样改变和稀发/无排卵为主要特征，常合并胰岛素抵抗(IR)，导致一系列代谢异常，这与2型糖尿病的临床表现相似。全基因组关联分析研究(Genome-wide association study，GWAS)表明高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2，HMGA2)为PCOS和2型糖尿病的共同易感基因[1-2]。HMGA2是一种非组蛋白染色体蛋白，本身并无转录活性，但可通过改变染色体结构来调节其他基因的转录[3]。研究表明，HMGA2可能参与调控卵巢高级别浆液性癌肿瘤细胞凋亡，且可能与卵巢上皮细胞癌的顺铂耐药性有关[4-5]。Jiao等[6]研究显示HMGA2基因的rs2272046位点的多态性与PCOS有关。目前未见有关于HMGA2基因rs2272046位点多态性与PCOS患者IR相关性的研究。本研究对河北PCOS人群HMGA2基因多态性进行分析，探讨HMGA2多态性与PCOS临床IR和发病风险之间的关系，为IR的发病机制提供研究思路。

资料与方法

一、研究对象

选取2019年5月至2020年1月于本院就诊的98例PCOS患者为研究对象。

98例PCOS患者(PCOS组)根据空腹胰岛素水平是否升高或耐糖量是否下降再分为胰岛素抵抗组(IR组，54例)和非胰岛素抵抗组(NIR组，44例)两个亚组。IR诊断标准[7]：(1)空腹胰岛素水平>15 mU/L；(2)根据1999年WHO诊断标准[8]诊断为糖耐量下降。符合该两个条件之一即诊断为IR。

纳入标准：PCOS诊断符合2003年鹿特丹诊断标准[9]；未伴有其它恶性肿瘤者；临床资料保存完整者；汉族人群。

排除标准：阴道超声检查，子宫及卵巢发现有器质性病变者；近3个月服用过激素类药物者；伴有内分泌、高血压等疾病者；有糖尿病家族史。

另选取同期例因单纯输卵管因素或男性因素不孕在本院生殖中心门诊就诊的86例非PCOS不孕妇女作为对照(对照组)。

本研究中所有患者均由主治医师明确诊断。本试验经医院临床研究伦理委员会批准，所有受试对象对本研究均知情并签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

核酸提取试剂盒和核酸自动提取仪(厦门致善生物)；SYBRPremixExTaqTMII Kit(大连宝生物)；荧光定量PCR仪(QIAGEN，德国)；PUZS-300自动生化分析仪(上海帝博思生物科技)；Beckman Dxi800型全自动免疫化学发光分析仪(Beckman，美国)。

三、研究方法

1.样品采集及保存：抽取所有受试者清晨空腹外周静脉血(PCOS组月经规律者在月经周期的第3～5天，月经不规律者在B超检查未见优势卵泡时)，3 000 r/min离心15 min后收集血清，迅速置于-80℃保存待测，用于血清学相关指标测定。

2.血清学相关指标测定：采用全自动生化分析仪测定血糖水平，化学发光法检测血清LH、FSH、睾酮(T)、胰岛素。稳态模型IR指数(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。

3.HMGA2基因rs2272046位点SNP检测：抽取受试者2 ml外周静脉血，EDTA抗凝。采用核酸提取试剂盒提取外周血基因组DNA。PCR引物由Primer 5.0软件设计，上海生工生物工程公司合成。上游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTGCAC-3′；下游引物：5′-TATCTGTGCGTGTGACAGCGGCT-3′。荧光PCR反应体系共20 μl：SYBRPremixExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.5 μl(10 μmol/L)，DNA 模板1.0 μl，ddH2O 8.0 μl。PCR程序为：95℃ 预变性 5 min；95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40个循环；72℃终末延伸5 min。PCR产物经溶解曲线或琼脂糖电泳验证，溶解曲线为整齐单一的特异峰或电泳条带为单一条带且条带长度符合，说明扩增成功。PCR产物纯化后送上海生工生物工程公司测序，BLAST进行测序结果比对，判读基因型。

四、统计学分析

结 果

一、患者一般资料及生殖激素水平比较

PCOS组与对照组间年龄、血清FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)；PCOS组体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、血清LH、T水平均显著高于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般资料及生殖激素水平比较(-±s)

二、Hardy-Weinberg遗传平衡检验

HMGA2在rs2272046位点上有3种基因型，分别为CC型、CA型、AA型。根据Hardy-Weinberg平衡定律，对照组、PCOS组以及IR和NIR亚组HMGA2在rs2272046位点上的各基因型的期望值和观测值符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)，提示群体来自同一孟德尔群体，所选样本进行群体遗传学研究具有代表性(表2)。

三、各组患者HMGA2基因rs2272046位点基因型和基因频率分布

对照组基因型中CC型(55.81%)最多，其次为CA型(37.21%)，AA型(6.98%)最少；PCOS组中CA、AA两种基因型占比较对照组显著升高(P<0.05)，且IR组中CA、AA两种基因型占比较NIR组显著升高(P<0.05)。IR组中的A等位基因频率显著高于NIR组，而C等位基因频率显著低于NIR组(P<0.05)(表3)。

表2 Hardy-Weinberg平衡检验

表3 各组患者HMGA2基因rs2272046位点基因型和基因频率分布[n(%)]

四、IR组患者HMGA2基因rs2272046位点不同基因型与血糖、胰岛素等的关系

IR组患者CA型和AA型基因型空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR水平均显著高于CC型患者(P<0.05)(表4)。

五、影响IR发生的多因素分析

将PCOS患者是否发生IR作为因变量，校正年龄、BMI、WHR、FSH、LH、T、空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR等混杂因素后，以HMGA2基因rs2272046位点的三种基因型(CC型、CA型、AA型)为自变量进行Logistic回归分析，结果显示AA型基因型是影响IR发生的独立危险因素(P<0.05)(表5)。

表4 IR组患者HMGA2基因rs2272046位点不同基因型与血糖、胰岛素等的关系(-±s)

表5 影响IR发生的多因素分析

讨 论

PCOS是一种复杂的、异质性较高的多基因疾病，其发生受基因与环境共同作用的影响，其中IR是PCOS重要的病理生理变化之一，大约60%～70%的PCOS患者发生胰岛素抵抗[10]，因此参与胰岛素代谢的基因在PCOS患者IR的发生发展中具有重要作用。而临床中PCOS的IR增加了高血压、脂质代谢异常等的发生风险[11]，因此研究胰岛素代谢相关基因，可能对疾病的预防有重要作用。

GWAS研究表明HGMA为PCOS的易感基因，HMGA2基因定位于12q14.3，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAEG)中有较强的迁移能力而得名。其编码的蛋白可作为构筑转录因子，可结合并改变染色质构象从而调节其他基因的转录；参与多个生物学过程的调控，在胚胎发生中高度表达，在大多数成熟和分化组织中几乎不表达[12-13]，通过促进细胞的增殖与迁移从而介导肿瘤的发生。HMGA2的过度表达可诱导卵巢上皮细胞发生恶化性转化，与卵巢癌的发生、发展密切相关，有文献报道HMGA2能促进PCOS患者的卵巢颗粒细胞增殖[14]。目前关于其基因多态性在PCOS中的研究报道较少[15-16]。

本研究结果显示，PCOS组的IR组患者中的A等位基因频率明显高于NIR患者，提示rs2272046 C/A位点多态性可能与PCOS患者发生IR有关。本研究进一步发现，发生IR的CA型及AA型基因型PCOS患者具有较高的空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR水平，进一步提示患者体内HMGA2基因rs2272046位点基因型表达异常可能影响患者体内血糖和胰岛素调节机制，而此调节机制的改变可能成为PCOS患者发生IR的主要因素，与陈曦[17]的结论基本一致。本研究的二元Logistic回归分析显示基因型AA型是影响IR发生的独立危险因素，进一步提示携带AA型基因型的PCOS患者可能更倾向于发生IR，推测HMGA2基因的rs2272046 A可能是PCOS患者罹患IR的易感等位基因。

本研究结果还发现，PCOS患者具有较高的BMI、WHR及LH等激素水平。朱文静等[18]研究结果显示，PCOS患者的BMI、WHR、LH及睾酮等水平均高于对照组，与本研究结果基本一致，提示部分肥胖患者可能导致PCOS的发生，进而出现血脂水平异常，推测血脂水平进一步影响患者体内激素水平，导致这些疾病之间相互关联、互相促进[19]

综上所述，HMGA2单核苷酸多态性与PCOS患者IR有一定相关性，其中CA型、AA型基因型可能与IR发生有关。该研究从基因层面探讨PCOS的发病机制，为今后PCOS的IR诊疗提供了新思路，但本研究存在一定的局限性：本研究为单个中心的临床试验，此结果仅能解释本地区HMGA2基因rs2272046位点单核苷酸多态性与PCOS患者IR存在一定相关性。因此，将来需大规模、多中心的临床研究来进一步证实及阐述HMGA2单核苷酸多态性在PCOS发病中的作用机制。