SOD在五味子乙素降低PM2.5对HTR细胞毒性中的作用

杨宁宁，董渠龙，焦立媛

大气颗粒物中空气动力学直径≤2.5μm的细颗粒物（fine particulate matter，PM2.5）是一种粒径小、面积大、活性强、成分复杂的环境污染物，其不仅可以吸附多种有毒有害物质，还能在大气中长时间停留及远距离输送，对人类健康存在严重威胁[1-2]，包括引起癌症[3]、呼吸系统疾病[4]、心血管疾病[5]、免疫系统功能障碍[6]、神经系统功能障碍[7]及生殖系统损害[8-9]。在生殖损害方面，笔者所在课题组的前期研究已经证实PM2.5在体外可以抑制人绒毛膜外滋养细胞的增殖及侵袭力，从而破坏滋养细胞的正常功能[10]，这与Wang等[11]的研究结果相一致。而滋养细胞被认为是维持妊娠的“核心元素”[12]，其功能受损则与不良妊娠结局息息相关，因此以人早孕胎盘绒毛膜外滋养层（human trophoblast HTR-8/SVneo，HTR）细胞为载体研究PM2.5的生殖毒性具有重要意义。

笔者所在课题组的前期研究通过反复实验论证，已经发现一定浓度的PM2.5对HTR细胞具有毒性作用，尤其150μg/mL浓度的PM2.5作用HTR细胞36 h后其细胞增殖抑制率达到21.97%，同时也发现一定浓度的五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）可以降低PM2.5对HTR细胞的毒性作用，且在0.1～2μmol/L浓度范围内降低PM2.5所致细胞毒性的能力随着Sch B浓度增加而增大，但潜在机制并不明确[13]。传统中药五子衍宗丸可以提高人类的生育力，Sch B是其君药五味子的主要成份。研究表明，Sch B可以降低氧化应激反应并抑制细胞的凋亡[14]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种重要的抗氧化酶，前期研究也已证实Sch B可以激活SOD基因以降低苯并(a)芘所致的HTR细胞毒性[15]，故推测SOD基因在Sch B降低PM2.5所致的HTR细胞毒性的过程中也发挥着重要作用。

本研究在前期研究的基础上，利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染技术干扰SOD mRNA表达，进一步利用多种实验方法从细胞增殖、SODmRNA表达、SOD蛋白表达层面上探讨SOD基因是否参与Sch B降低PM2.5损伤HTR细胞的过程，对于进一步阐明Sch B保护人类生殖能力的作用机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料HTR细胞株由加拿大Graham教授惠赠，PM2.5（中国药品生物制品检定所），Sch B（中国药品生物制品检定所），RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司），MTS细胞增殖检测试剂盒（Promega北京生物技术有限公司），SOD siRNA转染试剂（美国Santa Cruz生物技术公司），实时聚合酶链反应（real-time PCR）试剂盒（北京全式金生物公司），SOD酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司），细胞培养箱（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），无菌超净工作台（苏州安泰空气技术公司），Imark酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养HTR细胞接种于规格为10 cm的细胞培养皿中，给予RPMI-1640完全培养基7 mL后置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中常规培养24 h。根据细胞生长情况适时进行换液、传代及SODsiRNA转染、MTS细胞增殖实验、real-time PCR和SODELISA实验。

1.3 SOD基因干扰对HTR细胞进行SODsiRNA转染以干扰SOD基因的表达，实验方法按照Santa Cruz公司提供的试剂说明书进行，分为对照组、非特异序列转染组（阴性对照组）及0.25、0.5、1μg SODsiRNA转染组，利用real-time PCR检测各组SODmRNA的表达情况，计算干扰效率。

1.4 MTS细胞增殖实验收集消化的HTR细胞制成单细胞悬浮溶液，将HTR细胞接种于96孔板中（每孔接种10 000个细胞），分为6组，分别为对照组、PM2.5组、0.25μmol/L Sch B组、0.5μmol/LSch B组、1μmol/L Sch B组和2μmol/LSch B组，每组5个孔，培养24 h后添加作用试剂，其中对照组无Sch B和PM2.5作用，其余各组作用试剂分别为150μg/mL PM2.5、0.25 μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5、0.5μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5、1μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5和2μmol/L Sch B+150μg/mL PM2.5，继续培养36 h后，利用酶标仪在492 nm波长处测出每孔的OD值。

将HTR细胞进行0.5μg SODsiRNA转染，然后重复该实验，以分析SODsiRNA转染后各组HTR细胞的增殖情况。计算公式如下：各组增殖率=各组平均OD值÷对照组平均OD值×100%；抑制率=（对照组增殖率－实验组增殖率）÷对照组增殖率×100%；保护率=（实验组增殖率－PM2.5组增殖率）÷PM2.5组增殖率×100%。

1.5 Real-time PCR实验对HTR细胞在SOD siRNA转染前后均进行SODmRNA表达量分析，实验分组同1.4部分，实验步骤按照北京全式金生物公司提供的real-time PCR试剂盒说明书进行。其中SOD引物上游序列为5′-GCCGATGTGTCTATTGAAGATTC-3′，下游序列为5′-AGCAGGATAACAGATGAGTTAAGG-3′，扩增产物长度231 bp，扩增条件为95℃变性30 s，50℃退火34 s，72℃延伸45 s，共进行35次循环得到扩增产物。利用2-ΔΔCt计算公式得到各基因相对表达水平，其中以GAPDH作为内源性参照。

1.6 SOD ELISA实验对HTR细胞在SODsiRNA转染前后进行SOD蛋白表达量分析，实验分组同1.4部分，实验步骤按照上海蓝基生物科技有限公司提供的SODELISA试剂盒说明书进行，各组蛋白表达量以相对于对照组的倍数表示。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。实验中各数据均为定量资料，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOD siRNA转染前各组对HTR细胞的增殖作用在SOD siRNA转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2 μmol/L Sch B组的细胞增殖率分别为对照组的78.03%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%。以此得出，与PM2.5组相比，0.25、0.5、1和2μmol/L Sch B组对HTR细胞的保护率分别为2.74%、7.91%、10.31%、14.07%，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1。

图1 SODsiRNA转染前Sch B及PM2.5对HTR细胞增殖的影响

2.2 SOD siRNA转染HTR细胞以及干扰效率分析各浓度SOD siRNA转染HTR细胞后，与对照组相比，阴性对照组（即转染非特异序列组）的SOD mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；而0.25、0.5、1.0μg SOD siRNA转染组的SOD mRNA表达量分别是对照组的86.83%、64.86%、38.16%，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。鉴于0.5μg SODsiRNA干扰效率为35.14%，比例适中，后续实验均以此剂量作为SOD基因干扰剂量，见图2。

图2 不同浓度SODsiRNA转染后SODmRNA表达情况

2.3 SOD siRNA转染后PM 2.5及各Sch B组对HTR细胞增殖的作用对HTR细胞进行SODsiRNA转染后，再次利用MTS细胞增殖实验测定各组细胞的增殖情况。其中，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组细胞增殖率分别降低为对照组的66.03%、66.95%、69.32%、71.15%、72.34%。其中，与PM2.5组相比，0.5、1、2μmol/L Sch B组细胞增殖率差异有统计学意义（均P＜0.01），0.25μmol/L Sch B组细胞增殖率差异无统计学意义（均P＞0.05），见图3。进一步分析SODsiRNA转染后各浓度Sch B对HTR细胞的保护率，分别为1.39%、4.98%、7.75%和9.55。且PM2.5组与0.5、1、2 mol/LSchB组相比，差异有统计学意义（均P＜0.01），而与0.25 mol/L SchB组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图3 SOD siRNA转染后各组HTR细胞的增殖情况

图4 SODsiRNA转染前后Sch B对HTR细胞的保护情况比较

2.4 SOD siRNA转染前后各组SOD mRNA的表达情况利用real-time PCR测定SOD siRNA转染前后各组SODmRNA的表达情况。在SOD siRNA转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的SOD mRNA表达量分别是对照组的1.11、1.26、1.47、1.86、2.25倍，与对照组相比，各组差异均有统计学意义（均P＜0.01）；在SODsiRNA转染后，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/LSch B组的SODmRNA表达量分别降至对照组的1.05、1.13、1.25、1.43、1.77倍，与对照组相比，PM2.5组差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图5。

图5 SOD siRNA转染前后各组SOD mRNA相对于对照组的表达情况

2.5 SOD siRNA转染前后各组SOD蛋白的表达情况利用ELISA测定在SOD siRNA转染前后各组SOD蛋白的表达情况。在SODsiRNA转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的SOD蛋白表达量分别是对照组的1.09、1.19、1.36、1.60、1.94倍，与对照组相比，各组差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而在SOD siRNA转染后，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的SOD蛋白表达量分别降至对照组的1.04、1.09、1.16、1.27、1.41倍，与对照组相比，PM2.5组差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图6。

图6 SOD siRNA转染前后各组SOD蛋白相对于对照组的表达情况

3 讨论

关于PM2.5对人类生殖系统的危害已成共识，相关报道指出PM2.5与早产、流产、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、出生缺陷及新生儿低出生体质量等不良妊娠结局密切相关[16-17]。其中滋养细胞的受累尤为重要，而现有的研究则证实了PM2.5对人类滋养细胞的直接毒性作用[10-11]。经前期反复论证，笔者所在课题组发现Sch B可以降低PM2.5对HTR细胞的毒性作用[13]，本实验在前期研究的基础上猜想Sch B实现这一保护作用与SOD基因的表达相关，故本研究在细胞、基因和蛋白三个层面进行了相关印证。

本研究对HTR细胞进行SOD siRNA转染，以达到SOD基因的表达受到人为干扰。实验发现，阴性对照组与对照组的SODmRNA表达无差异，说明转染技术本身并不会干扰SOD基因的表达，而0.25、0.5、1.0μg SODsiRNA转染后，其SODmRNA表达分别下降至对照组的86.83%、64.86%、38.16%，干扰效果明显，最终选择0.5μg SOD siRNA用于后续HTR细胞转染，因为其35.14%的干扰效率较为合适。

首先，在细胞层面上，本研究利用MTS细胞增殖实验检测各组在SODsiRNA转染前后HTR细胞的增殖情况。在转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的细胞增殖分别为对照组的78.03%、80.17%、84.20%、86.07%、89.01%，而在SODsiRNA转染后，其细胞增殖率分别降至66.03%、66.95%、69.32%、71.15%、72.34%，说明SOD基因的干扰增加了PM2.5对HTR细胞的毒性作用，同时分析Sch B的保护作用，在SOD siRNA转染前，0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的细胞保护率分别为2.74%、7.91%、10.31%、14.07%，在SODsiRNA转染后，其细胞保护率分别降至1.39%、4.98%、7.75%、9.55%，说明SOD基因的干扰降低了Sch B对HTR细胞的保护作用。这在细胞层面上证实SOD基因参与了Sch B降低PM2.5对HTR细胞毒性的过程中。

随后，本研究采用real-time PCR实验从基因层面上去印证SOD基因在Sch B降低PM2.5对HTR细胞毒性中的作用。在SOD siRNA转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/L Sch B组的SOD mRNA分别是对照组的1.11、1.26、1.47、1.86、2.25倍，而在SOD siRNA转染后，以上各组的SODmRNA表达量则分别降至对照组的1.05、1.13、1.25、1.43、1.77倍，除PM2.5组外，其余各组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。这说明无论SODsiRNA转染前后，Sch B均可以激活SOD基因，且在实验中的Sch B浓度范围内，其激活SOD基因的表达量与Sch B的浓度呈正相关，但是在SODsiRNA转染后，Sch B激活SODmRNA的能力明显下降。由此联系MTS细胞增殖实验的结果，不难发现，Sch B在不同剂量下激活SOD基因的能力与对HTR细胞的保护能力相一致，这在基因层面上证实，Sch B可以通过激活SOD基因降低PM2.5对HTR细胞毒性。

但是，有一个问题值得注意和探讨，就是PM2.5作为HTR细胞毒性物质在实验中同样也能轻微地激活SOD基因表达，通过查阅相关文献，本文笔者分析这应该是PM2.5在对HTR细胞产时毒性时细胞启动内源性保护机制从而激活SOD基因表达所致，但这种内源性保护方式仅是一种细胞应答，不能完全抵抗PM2.5的强致毒性，所以在细胞层面上仍表现为细胞损伤，而在基因层面上可以检测到SODmRNA的高表达。

最后，本研究利用SODELISA实验在蛋白层面验证SOD在Sch B降低PM2.5对HTR细胞毒性中的作用。结果表明，在SOD siRNA转染前，PM2.5组及0.25、0.5、1、2μmol/LSch B组的SOD蛋白表达量分别是对照组的1.09、1.19、1.36、1.60、1.94倍，而在SOD siRNA转染后，以上各组的SOD蛋白表达量则分别降至对照组的1.04、1.09、1.16、1.27、1.41倍，除PM2.5组外，其余各组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。这说明无论SODsiRNA转染前后，Sch B均可以增加SOD蛋白表达量，且在实验中的Sch B浓度范围内，其增加SOD蛋白的表达量与Sch B的浓度呈正相关，但是在SODsiRNA转染后，Sch B增加SOD蛋白表达量的能力明显下降，这与各组转染前后SOD mRNA的表达完全一致，所以在蛋白层面上也表明，Sch B可以通过增加SOD蛋白的表达量降低PM2.5对HTR细胞毒性。

综上所述，本研究从细胞、基因和蛋白3个层面证实了SOD基因的高表达在Sch B降低PM2.5对HTR细胞的毒性作用中发挥了重要作用，这也许只是Sch B降低PM2.5所致HTR细胞损害的作用机制之一，但让Sch B的保护人类生育力的作用途径变得逐渐清晰，后续的研究仍需探讨Sch B发挥保护作用的分子通路，以期能够为改善人类生殖能力取得突破。