石家庄地区新生儿G6PD缺乏症筛查结果及基因突变分析

封露露，李丽欣，马翠霞，封纪珍，李扬

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症系由G6PD基因突变导致酶活性降低所致，其发病常由误食蚕豆而诱发，故又称蚕豆病[1]，是一种常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病，遗传方式为X连锁不完全显性遗传。根据酶活性缺乏程度与临床表现，可将G6PD缺乏症分为Ⅰ～Ⅴ型5类，其溶血的严重程度与剩余酶的功能呈负相关，临床症状也随之逐步减轻[2]。我国是该病的高发区之一，并呈南高北低的分布特点，患病率一般为4%～15%，海南、广东、广西、云南、贵州、四川、台湾和香港等省和地区较高[3]，个别地区可高达40%[4]。G6PD缺乏症在临床上表现为新生儿高胆红素血症、蚕豆病、药物诱导性溶血、某些感染性溶血以及非球形红细胞溶血性贫血，严重者可导致新生儿核黄疸，引起死亡或永久性神经系统的损伤[5-6]。本研究采用荧光技术对石家庄地区出生的237 312例新生儿进行筛查，进一步采用高通量测序技术（next generation sequencing，NGS）对疑似患儿进行基因测序，分析G6PD基因突变情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2018年9月—2020年11月于石家庄市内各助产机构出生的237 312例新生儿（男性123 363例，女性113 949例），采用荧光法进行G6PD活性筛查，得到筛查阳性患儿142例，确诊114例。其中56例采集静脉血进行基因测序，另外58例患儿家长拒绝基因诊断。筛查前家长均签署知情同意书，此研究经石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准实施。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂仪器：Wallac VICTOR2D荧光计和Wallac DELFIAPlate Shaker微孔板震荡仪，来源于PerkinElmer公司。试剂：G6PD测定试剂盒（荧光法），来源于Labsystems Diagnostics Oy。

1.2.2 G6PD活性筛查采用G6PD测定试剂盒（荧光法）进行G6PD活性的筛查，方法如下：首先用16 mL底物缓冲液溶解底物；在微孔板孔内分别打入直径3 mm的标准品、质控品和待测样本，每孔加入150μL底物溶液，确保血片完全浸透；微孔板覆膜，室温下避光孵育30 min，振速1 150 r/min；加入150μL冷的铜试剂并测量荧光读数（激发光波长355 nm，发射光波长460 nm）。结果判定：低于切值（3.5 U/g Hb）者为可疑阳性，即G6PD活性可能缺乏，需做进一步诊断。

1.2.3 质量控制筛查实验每块反应板均做单孔标准曲线和高值、低值质控，结果均在允许误差范围内方可发出检测报告。连续2年参加国家卫生健康委员会临床检验中心新生儿筛查室间质评，成绩合格。

1.2.4 G6PD基因测序可疑阳性患儿采集静脉血，送至北京迈基诺医学检验所，利用NGS按照Illumina标准化流程进行G6PD全外显子测序。对发现的致病突变在其所在片段上、下游设计引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增及一代验证。对患儿父母也采用Sanger法进行目标基因突变验证。对于未见报道的变异，应用蛋白功能预测软件SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster、GERP++和REVEL进行蛋白功能预测。严格按照美国医学遗传学与基因组学会（ACMG）发布的变异解读指南进行突变位点的致病性分析。

2 结果

2.1 石家庄地区新生儿G6PD缺乏症的患病率237 312例新生儿中，筛查阳性142例，确诊114例，总患病率为0.05%。114例患儿中男性105例，筛查结果均值（范围）为1.8（0.4～3.7）U/g Hb；女性9例，筛查结果均值（范围）为2.9（1.8～4.0）U/g Hb，见表1。

表1 石家庄地区新生儿G6PD缺乏症男性患儿及女性患儿对比分析

2.2 G6PD基因突变类型分析114例筛查阳性患儿中58例患儿家长拒绝基因测序，56例进行了基因测序，均为G6PD基因杂合突变，共包含19种突变类型，且均为点突变，其中16种已报道，分别为c.1376G>T、c.1024C>T、c.1388G>A、c.871G>A、c.95A>G、c.487G>A、c.1478G>A、c.406C>T、c.577G>A、c.925A>T、c.185 A>G、c.961 G>A、c.482 G>T、c.653 C>T、c.392 G>T、c.1466G>T；3种未见报道，分别为c.1316G>A、c.575G>C、c.1400C>T，见图1；突变频率较高的分别为c.1376G>T（0.25）、c.1024C>T（0.16）、c.1388G>A（0.14），见表2。

图1 3种未见报道的G6PD基因突变

表2 56例G6PD缺乏症患儿基因突变类型

3 讨论

3.1 G6PD缺乏症的患病率分析G6PD缺乏症在中国儿童总体患病率为4.03%，患病率相对较高，为我国较高的遗传性疾病之一[7]。Chiang等[8]报道中国台湾地区患病率为3.1%～9%；另有报道在广东省进行的一次8 144例筛查中，患病率为3.1%～16.1%[9]；云南省患病率为7.39%[10]；四川省部分地区患病率达6.9%[11]；贵州省的患病率为3.43%[11]；香港的患病率为4.4%[12]；我国北方地区的山东青岛该病患病率仅为0.02%[13]；山东聊城患病率则为1.6%[14]；陕西宝鸡地区患病率为0.02%[15]。本研究初步明确G6PD缺乏症在石家庄地区患病率为0.05%，与河北省廊坊市患病率（0.05%）[16]一致，提示G6PD缺乏症在我国发生率存在南高北低的特点，亦表明该病具有种族及地域差异。

3.2 G6PD缺乏症的性别差异G6PD缺乏症是由基因突变引起，致病基因位于X染色体上，故呈现出X连锁遗传的遗传特点。男性半合子酶活性表现为显著缺乏而发病；女性杂合子酶活性呈现不同程度降低，多不发病或轻度发病；女性纯合子会表现出酶活性的严重缺乏[17]。本研究发现56例患儿中除2例女性杂合子，其余均为男性半合子，未发现女性纯合子；男性患病率为0.085%，女性患病率为0.008%。

3.3 G6PD基因突变分析G6PD缺乏症的患病率、基因频率及基因突变类型具有明显的地域和群体特异性。非洲地区主要以c.376A>G、c.202G>A、c.A542T突变为主；地中海地区以及印度等国家主要以c.563C>T为主；东南亚地区则主要以c.871G>A为主；亚洲地区的中国人突变位点主要是c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G[18-19]；本研究表明石家庄地区突变频率较高的位点为c.1376G>T（0.25）、c.1024C>T（0.16）、c.1388G>A（0.14），提示石家庄地区G6PD缺乏症基因突变逐渐呈现地区特征。

综上，本研究通过对石家庄地区新生儿G6PD筛查结果及基因突变分析，明确了G6PD缺乏症在石家庄地区新生儿中的患病率，且男性高于女性；进一步分析了基因突变位点的分布情况；发现了3种未见报道的基因突变类型，丰富了基因突变的数据库。