褪黑素抑制氧化应激促进牦牛卵母细胞体外成熟的研究

彭巍，黄荣，舒适，徐尚荣,张君

(青海大学畜牧兽医科院，西宁 810016)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原农牧民生产生活的主要生产资料，是农牧民必须的肉、乳、绒的主要来源。牦牛群主要分布在海拔3000m～6000m的低温缺氧地区，恶劣的自然环境条件为牦牛的生长和繁殖带来了很多不利因素，目前主要运用体外成熟的卵母细胞进行体外受精、体细胞核移植等胚胎生物技术来改善繁殖率。在正常的体内发育过程中，卵母细胞处于缺氧环境中，卵泡液中含有自由基清除剂和抗氧化酶，保护卵母细胞免受氧化损伤[1，2]，但体外培养过程中，卵母细胞、精子和胚胎暴露在高氧环境下[3]，输卵管和子宫内环境保护的缺失降低了抗氧化剂的产生，并导致氧化还原失衡[4]。因此，为了提供体外或体内胚胎发育更好的条件，维持细胞内氧化还原状态的平衡是很重要的[5]。

褪黑素(Melatonin，MT)是由哺乳动物松果体合成并分泌的一种吲哚类激素，松果腺以外的组织中都可产生，包括卵巢、睾丸、子宫、胎盘、皮肤、骨髓、肠道和晶状体。褪黑激素是一种多功能分子，参与生理过程，如昼夜节律、生殖、清除自由基、抗炎症和抗凋亡[6，7]。作为一种有效的自由基清除剂和广谱抗氧化剂，褪黑素及其代谢物可直接清除ROS并减少细胞氧化损伤[8]。最近的研究表明，牛[9]和猪[10]的卵泡液中存在褪黑激素，在卵母细胞培养过程中补充褪黑激素可以提高受精能力和牛、人、猪的卵母细胞发育[11，12]。然而体外成熟期间补充褪黑素改善卵母细胞质量的潜在机制尚未完全明确。

该项研究探讨不同浓度的褪黑素添加到卵母细胞体外成熟液中对体外牦牛卵母细胞成熟的影响。分析褪黑素对牦牛卵母细胞成熟后的卵裂率和囊胚率、线粒体分布、GSH水平的影响，从而进一步阐明褪黑素对牦牛卵母细胞质量和随后IVF胚胎发育的影响，旨在提高牦牛IVF胚胎的发育能力，提升牦牛育种及良种推广途径，以加快青藏高原牦牛良种推广力度和覆盖面。

1 材料与方法

1.1 主要试剂配制

卵母细胞体外成熟液(IVM液)：TCM-199+25mM Hepes+10%FCS+0.2mM丙酮酸钠+0.2U/ml FSH+1μg/ml+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素+0.26mM NaHCO3。G1.5/ G2.5 购买于vitrolife公司，瑞典。BO工作液(Bracket and Oliphant’ s medium)：先配制Stock A和Stock B。Stock A配制方法，称取NaCl 6.55g，KCl 0.3g，NaH2PO4·H2O 0.113g，CaCl2·2H2O 0.33g，MgCl2·6H2O 0.106g，加入去离子水，定容至100mL。Stock B配制方法，称取NaHCO3 1.3g，加入去离子水，定容至100mL。取Stock A10mL，Stock B 23.87mL，Na-pyruvate 13.75mg，Gentamicin stock 100μL，Glucose 250mg，加入去离子水，定容至100mL，过滤除菌，4℃保存备用。制作精子微滴的BO液为含6mg/mL BSA和4.5mg/mL Theophylline的BO工作液。

1.2 牦牛卵母细胞收集和体外成熟

牦牛卵巢采集自西宁市裕泰屠宰场。离体的卵巢迅速保存于16 °C～25 °C的含有青霉素、链霉素生理盐溶液中，放置保温桶内并于4h内带回试验室；使用12号10mL注射器从直径3mm～8mm的窦卵泡腔中吸取卵泡液，并在体视显微镜下将胞质完整均匀、具有完整卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte Complex，COCs)检出。将COCs在成熟液中清洗后，移入含有不同浓度的褪黑素(0、10-7、10-9和10-11M)的4mL卵母细胞体外成熟培养液的培养皿中，在38.5℃，5% CO2、饱和湿度条件下培养。24h后统计第一极体排出率，卵母细胞的成熟率计算以第一极体排出的比率作为标准。

1.3 牦牛卵母细胞的体外受精和体外胚胎培养

牦牛卵母细胞在体外成熟24h后，使用移液枪对卵母细胞轻微吹打，去除其周围的颗粒细胞，选取胞质均匀且排出第一极体的卵母细胞移入提前12h平衡的BO液微滴中，并用石蜡油覆盖，每滴20～25个卵母细胞。38℃～42℃的温水中迅速解冻精子，用自制精子针迅速将精液移入含2mLBO液的圆管底部，45度倾斜精子上浮1h，完成精子获能。吸取液面部分精液，1500 r/min离心5min 后，弃上清，剩余液体与精子混匀后加入到上述含有成熟卵母细胞的微滴中；受精24h后，在含有0.1%牛睾丸透明质酸酶的PBS中剥离卵丘细胞和多余的精子，然后在含有5% CO2的95%湿润空气中于38.5℃下在G1.5培养液中培养；3d后换液，转入G2.5液中继续培养， 培养至7d收集囊胚，并统计卵裂率、桑椹胚率以及囊胚率。所采用的精液取自青海省家畜改良中心，精液为含野牦牛1/2血的大通牦牛冻精。

1.4 牦牛卵母细胞内GSH的测定

收集体外成熟24h后的对照组和褪黑素(10-9M)组的卵母细胞，挑出胞质均匀且有第一极体的卵母细胞。ThiolTracker TM Violet(T10096，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)用于分析牦牛卵母细胞还原型GSH的水平，对牦牛成熟卵母细胞操作方法按照说明书进行操作。使用荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)捕获卵母细胞，使用Image-Pro Plus软件分析GSH的荧光强度。

1.5 牦牛卵母细胞内DNA 损伤的测定

将体外成熟的牦牛卵母细胞在PBS-PVA溶液中冲洗3次，5min/次。将卵母细胞至免疫染色固定液(Beyotime)中固定，室温下孵育1h；固定后卵母细胞再移至含0.2% Triton X-100的PBS溶液中透化，孵育30 min；通透后的卵母细胞在PBS-PVA溶液中吹洗3次，5min/次；冲洗后的卵母细胞移至免疫染色封闭液(Beyotime)中封闭，4℃条件下孵育12h。封闭后的牦牛卵母细胞与DNA损伤抗体(1：500；Abcam，UK)孵育；洗涤3次后，将卵母细胞与二抗室温避光孵育2h。卵母细胞用用荧光显微镜捕获，使用Image-Pro Plus软件分析DNA损伤水平。

1.6 牦牛卵母细胞凋亡水平的测定

Annexin V-FITC凋亡分析试剂盒(Beyotime)用于评估卵母细胞中磷脂酰丝氨酸外化的早期凋亡卵母细胞。将195μL膜联蛋白V-FITC结合溶液，5μL膜联蛋白V-FITC和10μL碘化丙啶轻轻混合。将样品在室温下在混合物中处理15min。在清洗溶液中洗涤三次后，使用高速共聚焦显微镜测量荧光信号。

1.7 牦牛卵母细胞线粒体膜电位的测定

用Mito-Tracker Green(Beyotime)测定牦牛在不同褪黑素浓度(0，10-9M)体外成熟后卵母细胞中线粒体的活性。MII卵母细胞经两次洗涤后，将MII期的卵母细胞与200nM 预温育的Mito-Tracker Green染色液，在37℃条件下一起孵育30min。除去染色液，滴加37℃条件下预温育M199培养液。将卵母细胞在新鲜的M199培养液中在38.5℃下洗涤15min。置于盖玻片上，通过荧光显微镜捕获卵母细胞图像，采用Image-Pro Plus软件对荧光强度进行分析。

1.8 数据统计和分析

采用单因素方差(One-ANOVA)和邓肯多重比较试验(Duncan multiple comparison test)分析，并采用SPSS 21.0软件(SPSS Inc.)进行分析。相关试验至少重复三次，测定数据代表所有重复试验的平均值。采用t检验方法对相关基因表达的进行了验证分析，P<0.05认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 成熟液中添加不同浓度的褪黑素对牦牛卵母细胞体外成熟的影响

各组卵母细胞体外成熟率见表1：与对照组与IVM+10-7组相比，IVM+10-9组(10-9M)和IVM+10-11组(10-11M)卵母细胞的成熟率显著提高，差异显著(P<0.05)；当浓度为10-9M时，卵母细胞的极体排出率达到最高。

2.2 成熟液中添加不同浓度褪黑素对牦牛卵母细胞后续胚胎发育能力的影响

各浓度处理组中卵裂率和囊胚率见表1：与对照组相比，IVM+10-9组和IVM+10-11组卵裂率和囊胚形成率显著升高，差异显著(P<0.05)；对照组与IVM+10-7组相比，卵母细胞的卵裂率及囊胚率不显著(P>0.05)，研究结果表明，卵母细胞体外成熟培养液中添加10-9M浓度的褪黑素，有助于提高卵母细胞的成熟率、胚胎卵裂率及囊胚率。

表1 体外成熟中添加不同浓度的褪黑激素对体外胚胎发育和质量的影响

2.3 褪黑素对牦牛卵母细胞体外成熟后氧化应激的影响

体外成熟后卵母细胞中GSH的水平如图1所示，与对照组对比，补充褪黑素组(10-9M)显著提高牦牛卵母细胞中GSH的相对水平(P<0.05)；体外成熟后卵母细胞中DNA损伤程度如图2所示，与对照组对比，补充褪黑素组(10-9M)显著减少牦牛卵母细胞中DNA损伤程度(P<0.05)。总的来说，添加10-9M浓度的褪黑素有助于提高卵母细胞体外成熟过程中GSH的水平，降低DNA损伤程度，从而降低氧化应激水平，提高卵母细胞的体外成熟率。

2.4 褪黑素抑制牦牛卵母细胞早期凋亡

如图3所示，在对照组中，IVM卵母细胞中清楚地检测到荧光信号，但在补充褪黑素组(10-9M)中很少观察到荧光信号。结果表明，褪黑素显著降低体外成熟过程中牦牛卵母细胞的早期凋亡水平(P<0.05)，提高卵母细胞体外成熟率。

2.5 褪黑素处理对牦牛卵母细胞IVM过程中线粒体恢复的影响

如图4所示，过量的ROS产生会导致线粒体蛋白质和DNA的损伤。试验研究了IVM牦牛卵母细胞中的线粒体活性和分布。荧光强度的定量显示，与对照组卵母细胞相比，褪黑素处理的卵母细胞中线粒体的信号显著增加，褪黑素组线粒体正常分布率高于对照组(P<0.05)。研究结果表明，10-9M浓度的褪黑素降低卵母细胞体外成熟过程中线粒体蛋白质和DNA的损伤程度。

3 讨论

在卵母细胞体外成熟的过程中，由于培养环境中氧含量存在差异，体外成熟的卵母细胞会承受更高的氧压，从而导致ROS产生过量。当 ROS 的产生速度超过其清除速度时会产生氧化应激，破坏生物大分子的正常结构，从而对体外成熟效率产生影响[13]。褪黑素作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂，能够显著降低细胞内ROS水平，清除自由基，改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育历程[14]，进而保护合子和胚胎。近年来，褪黑素在提高体外培养卵母细胞和胚胎发育方面得到了越来越多的证实，但其对牦牛卵母细胞体外成熟的影响机制还尚未明确。

本研究测定了在不同培养条件下添加不同浓度的褪黑素对牦牛体外成熟过程是否会改善卵母细胞的质量。研究发现，添加10-9M褪黑素的体外培养液可显著提高牦牛卵母细胞的体外成熟率，进而改善后续的胚胎发育能力。除此之外，与对照组相比，当添加10-7M浓度的褪黑素时，卵母细胞的体外成熟并没有受到显著的影响。尽管褪黑素在体外卵母细胞成熟和胚胎发育方面有所改善，但褪黑素的有益作用似乎在绵羊[15]、兔[16]、猪[17]和小鼠[18]等动物上具有特异性和浓度依赖性，特别是在抗氧化保护[19]，增强免疫功能，睡眠和繁殖等方面[20]。

褪黑素作为抗氧化剂和自由基清除剂，通过清除自由基，直接消除ROS，通过该系统起作用，增加编码抗氧化酶如SOD和GSH的基因的表达，并且抑制促氧化酶的作用以减少细胞氧化应激[21，22]。已有研究表明，在牛的体外成熟培养基中添加一定浓度的褪黑素，可以促进细胞器的正常分布、GSH 和ATP含量增加、抗氧化基因表达水平的提高，进而促进卵母细胞受精和发育能力[12]。在本实验中，与对照组相比，培养液中添10-9M浓度褪黑素组的成熟卵母细胞内GSH的含量更高，凋亡率降低，表明添加10-9M浓度的褪黑素在所述条件下的卵母细胞体外成熟过程直接影响卵母细胞的质量，进而提高牦牛体外受精胚胎的囊胚率。

线粒体是正常卵母细胞发育的关键，并且是卵母细胞和早期胚胎中ATP生产的主要来源[23]。线粒体功能障碍与染色体分离障碍、受精失败、卵母细胞破碎和线粒体引起的细胞凋亡的减少密切相关[24]。有研究报道，卵母细胞体外成熟过程中过量产生的ROS会导致线粒体蛋白质和DNA的损伤[25，26]。在本研究中，我们发现在卵母细胞体外成熟过程中用褪黑素处理可以有效缓解氧化应激，并且恢复线粒体的活性。

4 结论

本研究发现褪黑素以10-9M的浓度添加到成熟液中可有效提高牦牛卵母细胞的成熟质量以及体外胚胎培养过程中囊胚的产生，证实了褪黑素在卵母细胞体外成熟阶段对减少细胞氧化应激和保护细胞免受凋亡引起的细胞死亡中起重要作用。这些数据为胚胎的冷冻保存，以及在冷冻保存的胚胎解冻后将褪黑素添加到培养液中的研究提供了理论依据。