热应激对体外小鼠早期囊胚发育至扩张囊胚期能力的影响

屈平平

（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊 261061）

夏季高温是导致奶牛等哺乳动物不孕和妊娠失败的主要原因，母牛在妊娠早期遭受热应激后，胚胎的死亡率和畸形率也明显增加[1-3]。驴为季节多次发情动物，7～9月份是德州母驴发情旺季，此时正值夏季高温，不利于胚胎的着床和发育，易导致妊娠失败；每年8～9月份，西藏野驴也进入繁殖交配期，如果西藏野驴引种至中原，也将面临热应激对其繁殖力的影响。本项目以小白鼠为动物模型，研究热应激对哺乳动物胚胎发育的影响。试验通过对小鼠早期囊胚进行不同程度的热应激处理，观察热应激对小鼠早期囊胚的后续发育力的影响，为探索热应激抑制奶牛等哺乳动物早期胚胎发育的机理提供一定的依据。

1 试验材料

1.1 试验动物

试验动物为昆明种（KM）8～9周龄性成熟小白鼠，体重25±0.5g，购买于山东大学实验动物中心。饲喂颗粒饲料，自由饮水，并进行光照控制（6:00-18:00光照，18:00-6:00黑暗）；温度控制在18～25℃。适应饲养一周后，用于超数排卵。

1.2 试验药品

NaCl，KCl，NaHCO3，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，EDTA，HEPES，BSA，谷氨酰胺，乳酸钠，丙酮酸钠，青霉素，硫酸链霉素，琼脂糖，地衣红（均购自Sigma公司）；PMSG和HCG购自宁波三生药业；柠檬酸钠，甲醇，乙酸，0.01MPBS等。

1.3 试验器材

体视显微镜（SZX-12，日本OLYMPUS公司），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司），CO2培养箱（Galaxy B，德国MMM公司），CO2培养箱（Steri-Cycle，美国Forma公司），透明加热板（p w-1，日本富士平公司），荧光显微镜（SZX-14，日本OLYMPUS公司）。

2 试验方法

2.1 小鼠胚胎体外培养

2.1.1 小鼠超数排卵将性成熟、生长健康的雌性昆明小鼠于16：00腹腔内注射PMSG（10IU/只），48h后腹腔注射HCG（10IU/只），雌鼠注射HCG后立即与成熟雄鼠1∶1合笼。次日早晨检查阴道栓，有阴栓者备用。

2.1.2 小鼠受精卵收集及体外培养在检出阴道栓的当天19:00左右，用颈椎脱臼法处死雌鼠，取出输卵管和部分子宫角，在体式显微镜下，将形态完好的受精卵在Hepes-CZB中冲洗5次后，转移至50μL预平衡6～12h的CZB培养液微滴中，每个液滴放置30枚胚胎，置于37℃、5%CO2、100%RH的CO2培养箱中进行培养。当胚胎发育至4-细胞期时，将胚胎转移至葡萄糖-CZB培养液中继续培养，直至发育至早期囊胚（图1），用于后续试验。

2.2 热应激处理

将早期囊胚分别在39℃，5.5%CO2条件下和41℃，6%CO2条件下热应激处理2h。热应激结束后，将胚胎在37℃，5%CO2条件下继续培养。对照组胚胎在37℃，5%CO2条件下连续培养。

2.3 热应激后小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的比例

分别在热应激结束后24h时，在体式镜下观察热应激早期囊胚发育到扩张囊胚的比率（图2）。试验重复4次，每个重复的胚胎数为45～50枚。

图1 发育至早期囊胚的小鼠胚胎

图2 发育至扩张囊胚的小鼠胚胎

2.4 热应激后小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的平均总细胞数

分别将热应激后24h收集的扩张囊胚，置于1%和0.5%低渗柠檬酸钠溶液中处理30min和20min，再移到3∶1（V/V）的甲醇-冰醋酸固定液中处理30min。而后将胚胎移至APES（3-aminopropyl-triethoxy silane）硅化的载玻片上，干燥后，滴加0.5mL1%醋酸地衣红染色液，室温下染色15～20min；水洗后，稍干燥，封片，镜检。记录每枚胚胎的总细胞数。试验重复3次，每个重复30～40枚胚胎。

3 结果

3.1 热应激对小鼠早期囊胚育到扩张囊胚比率的影响

正常培养组（37℃连续培养）、温和热应激组（39℃2h培养）、强烈热应激组（41℃2h培养）早期囊胚发育到扩张囊胚率分别为81.7±6.5%，80.8±6.4%和63.3±3.6%；与正常培养组相比，温和热应激组早期囊胚发育到扩张囊胚的比率差异不显著。但是，强烈热应激后小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的比率降低了22.5%，与正常培养组和温和热应激组差异显著（P＜0.05）。以上结果表明强烈热应激显著降低体外小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的能力。

表1 热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚比率的影响

3.2 热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚总细胞数的影响

正常培养组、温和热应激组和强烈热应激组小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的平均总细胞数分别为57.11±1.7、49.89±1.3和42.22±2.0。与正常培养组相比，温和热应激组和强烈热应激组早期囊胚发育到扩张囊胚的平均总细胞数分别减少了8个和15个，与对照组均差异显著（P＜0.05），以上结果表明热应激能抑制小鼠早期囊胚的细胞分裂，这可能是热应激造成部分胚胎死亡的原因之一。

表2 热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚总细胞数的影响

4 讨论

国内外研究发现在合子形成期间对母鼠进行35℃12h热应激，受精卵发育到桑椹胚和囊胚的比率明显降低；41℃1～2h热应激就能降低体外2-细胞期胚胎的囊胚形成率。也有学者发现43℃2h强烈热应激显著降低了体外桑椹胚的存活率和囊胚形成率。本试验也发现，39℃2h的温和热应激对小鼠早期囊胚发育到扩张囊胚的比率几乎没有影响，但是41℃2h的强烈热应激能显著降低早期囊胚发育到扩张囊胚比率，说明小鼠早期囊胚不能耐受短时间的强烈热应激。