体外受精-胚胎移植技术中囊胚培养密度对胚胎发育潜能的影响

陈棪焜 冼卓杰 池霖生 黄建洲 马文敏

广东省佛山市妇幼保健院辅助生殖技术中心，广东佛山 528000

体外受精-胚胎移植技术是一种人工生育技术，体外胚胎培养是传统的胚胎体外培养方式，对移植胚胎是否能够正常发育难以保证且容易产生多胎的情况，给顺利分娩增加了难度，因此临床上开始寻找一种能够有效检测早期胚胎并提高移植率的方法，结果发现囊胚培养能够较为有效的解决这些问题[1-2]。胚胎在培养过程中从受精卵形成4 细胞、8 细胞，经过融合形成囊胚，囊胚的植入率也相对较高。在正常情况下，母体能够给胚胎提供最适宜生长和发育的环境条件，且能够随时进行代谢更新，以避免代谢物质产生的毒副作用对胚胎的发育产生影响。胚胎实验室无法满足上述条件，其进行的体外培养虽然已经尽量贴近母体内的环境，提供胚胎发育的各种条件，但仍然存在一定的差异性，外界因素仍会对其产生影响，同时，不同生殖实验室在培养时所使用的方法也存在差异性[3-4]。其中，临床在关于进行囊胚培养实验时对密度的选择方面存在有较多争议，为探究适宜的培养密度，本研究对不同密度培养下的胚胎培养结果进行比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至12月佛山市妇幼保健院接受体外受精移植的235 例体外受精胚胎移植患者为研究对象，患者年龄为31～40 岁，平均（34.55±4.21）岁；文化程度：小学及以下学历15 例，中学67例，专科、本科82 例，硕士及以上学历71 例；不育年限1～12年，平均（4.75±1.26）年；焦虑自评量表[5]评分为39～61 分，平均（50.22±3.17）分；抑郁自评量表[5]评分为37～62 分，平均（51.24±3.61）分。共移植培养裂卵期胚胎1181 个，按照培养密度差异分为四组，分别为单独培养为A 组，2～3 个集中培养为B 组，4～5 个集中培养为C 组，6 个以上集中培养为D 组，其中A 组培养囊胚共269 个，B 组培养囊胚共298 个，C 组培养的囊胚共304 个，D 组培养囊胚共310 个。患者对本研究内容知情并签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：均顺利完成体外受精且受精卵在3 d内发育状况良好者。

排除标准：胚胎为卵细胞浆内单精子显微注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受 精；补 救ICSI 周期性的胚胎；胚胎发育与至第5 天处于桑葚状态即将被移植或进行冷冻；受精成功后未能正常发育的胚胎；患者抑制胚胎超过卵裂期胚胎。

1.2 方法

所有胚胎均于取卵后第3 天进行囊胚体外培养，分别采用单独培养与不同囊胚数量集中培养，在开始囊胚培养的前一天下午制备囊胚培养器皿，使用囊胚培养液在培养皿中制作30 μl 的微滴并在上面覆盖培养油制成胚胎囊胚期的培养皿。单独培养囊胚组每次取1 个裂卵期胚胎转移到培养皿中，集中培养组分别按照每组的培养数量分别取每2～3 个、4～5 个以及6 个以上的裂卵期胚胎转移到培养皿中，所有胚胎均在相同的混合气体培养箱中进行培养。对几组囊胚形成的结果进行观察比较。

为控制研究质量，在进行胚胎评估时由3 名具备丰富经验的胚胎工作者同时进行评估，当评估意见无法统一时采用无记名投票的方式进行评估结果收集，以多数结果作为最终评估结果。

1.3 观察指标及评价标准

①四组囊胚培养结果比较：囊胚期对四组囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率进行比较。囊胚等级使用Gardner 评分系统[5]进行评价，首先根据囊胚扩展及孵出程度进行1～6 级评价，1 级为早期囊胚，囊胚胚腔体积低于囊胚总体积的一半；2 级为囊胚胚腔体积达到囊胚体积的一半以上；3 级为完全扩展的囊胚，囊胚胚腔占据整个囊胚；4 级为扩展后囊胚，囊胚腔体与移植培养初期相比明显扩大，透明带有变薄迹象；5 级为正在孵化的囊胚，囊胚自透明带裂口中孵出；6 级为孵化出的囊胚，囊胚已经完全从透明带中脱出。可利用囊胚评价标准为Gardner 评分系统[5]评价结果等级不低于2 级的囊胚，优质囊胚评价标准为4 级及以上的囊胚。②四组形成囊胚等级差异比较：参照Gardner 评分系统[5]依据囊胚腔、内细胞团以及滋养层细胞对所有形成的囊胚进行等级评价，其中，囊胚腔分6 期，1 期表示囊胚腔占据囊胚总体积一半以下；2 期表示囊胚腔占据囊胚总体积一半以上；3 期表示囊胚腔完全占据胚胎的总体积；4 期表示囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5 期表示正在孵出的胚胎，胚胎的一部分从透明带逸出；6 期表示孵出的胚胎，囊胚完全从透明带中逸出。③四组着床情况及妊娠结局比较：将形成的囊胚全部进行囊胚移植，于B 超下看到妊娠囊确定为临床妊娠标准[6]；着床率=着床胚胎数/移植胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%。

1.4 统计学方法

使用SPSS21.0 数据分析软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计数资料使用率表示，组间比较及多组率的整体比较使用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。多组率的两两比较采用Bonferroni 方法校正，检验水准α=原α 水平/比较次数，即0.05/6≈0.008。

2 结果

2.1 四组胚胎囊胚培养结果的比较

四组的囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；C 组的囊胚形成率、可利用囊胚率高于A、B、D 组，差异有统计学意义（P＜0.008），优质囊胚率高于A、B 组，差异有统计学意义（P＜0.008）（表1）。

表1 四组胚胎囊胚培养结果的比较[n（%）]

2.2 四组胚胎形成囊胚等级差异的比较

四组胚胎共形成778 个胚囊。四组囊胚形成的等级比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。C 组的囊胚4～6期占比高于A、B、D 组，差异有统计学意义（P＜0.008）（表2）。

表2 四组胚胎形成囊胚等级差异的比较[n（%）]

2.3 四组胚囊着床情况及妊娠结局的比较

四组囊胚囊胚着床率、临床妊娠率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；C 组的囊胚着床率、临床妊娠率高于A、B、D 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 四组胚囊着床情况及妊娠结局的比较[n（%）]

3 讨论

体外受精-胚胎移植技术作为人类辅助生殖技术在临床上是十分重大的一项突破，20 世纪60年代初至80年代中期，人们以各种哺乳动物为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。这为之后临床上应用该项技术治疗不孕患者提供了早期的理论基础。在对不孕症患者的治疗中，体外受精技术与胚胎移植技术具有明显的相关性，当受精卵经人工孵育在适宜的条件下分裂达到8～16 个卵裂细胞时，再使用人工方法移入分泌期的妇女子宫内，使孕卵着床，进而使其怀孕并通过宫内孕育顺利产下胎儿[7]。体外受精和胚胎移植技术相结合，也就是通常所说的“试管婴儿”技术，随着科学的发展，这一技术在不孕症治疗中将发挥更大作用。一个优化的培养体系能够使有活力的胚胎在体外或移植后形成囊胚并最终发展为正常胎儿[8-9]。通常对患者进行取卵后4～6 h 内将经过处理的丈夫精子与卵子一起培养，精子通过自身的运动进入到卵细胞中两性的遗传物质结合进而形成受精卵，最后经过培养就能够形成4 细胞、8 细胞的胚胎，囊胚培养是胚胎在体外培养的终末阶段，进行囊胚移植通常能够获得较高的胚胎植入率并能够有效避免多胎的形成，因此进行囊胚培养和移植是临床医患都更为认可的选择，而在体外培养阶段影响其质量因素很多。

临床研究发现实验室培养的环境以及胚胎形态都会对最终的发育形成影响。胚胎培养实验室已经应用了人类发展的高科技产物[10-11]。但在自然状态下，母体能够提供胚胎在免光照、恒温、恒气体分压即最符合胚胎需要的二氧化碳、氧、氮分压等环境因素、最合理配比的营养物质及对胚胎发育至关重要的必要性细胞因子而且这些物质随时保持动态更新、不存在代谢废物过度堆积的情况也就不会对胚胎产生毒副作用影响。这些条件在胚胎实验室里能够最大限度的进行粗略模拟但是却难以完全达到[12-13]。佛山市妇幼保健院具有成熟的体外受精-胚胎移植技术，在进行胚胎移植的过程中发现即使对培养环境严格控制仍然难以保证囊胚质量及移植成功率，因此考虑囊胚的发育结果和其培养时选择的密度差异存在一定的影响[14-15]。对于囊胚培养的密度选择在不同的胚胎实验室都会有不同的选择，部分胚胎工作者认为进行单一的培养更加利于对胚胎发育状况进行追踪，且囊胚不会受到周围囊胚代谢的毒副产物的影响，但是也有学者指出囊胚自分泌和旁分泌的相关生长因子对其发育存在积极影响[16-17]。在进行群体培养时通常会定时对培养液进行更换以补偿其代谢毒性，而这种方式会对胚胎的发育造成影响，将自分泌生长因子和旁分泌生长因子也去除了[18-19]。因此如何选择囊胚培养的密度仍然没有统一定论，同时从胚胎培养发育的机制来看密度对囊胚存在明显影响。本研究结果显示，C 组的囊胚形成率、可利用囊胚率以及优质囊胚率均高于A、B、D 组（P＜0.008），提示培育过程中将培养密度保持为4～5 个集中培养囊胚的发育潜能更好。本研究结果显示，C 组的囊胚4～6 期占比高于A、B、D 组，囊胚着床率、临床妊娠率高于A、B、D 组，差异有统计学意义（P＜0.008），提示该培养密度的优势。本研究在相同培养液容积的情况下进行不同数量的囊胚培养，A、B 两组仅集中培养1～3 个囊胚，培养密度较大，而D 组集中培养囊胚数量在6 个以上，囊胚间的密度较小，几种培养密度下胚胎的质量以及其发育潜能甚至移植成功率均较低，提示在进行囊胚培养时应当根据培养液容量选择合适的培养密度进行囊胚培养以增加培养成功率及移植成功率，对患者的妊娠结果具有改善作用。

综上所述，培养囊胚时囊胚培养密度为1～3 个以及6 个以上集中培养的囊胚的发育潜能低，可利用囊胚的形成、最终的着床及妊娠结果对比差异也低，4～5个囊胚集中培养密度环境下囊胚的培养结果更好，且囊胚培养时密度不宜过大也不宜过小，应该根据培养液的容量大小进行密度选择以提高胚胎移植率和患者临床妊娠率。