牦牛GHR基因部分片段SNP多态对乳成分影响的研究

金鑫燕

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

生长激素受体 (growth hormone receptor，GHR)是众多被认为影响泌乳性能候选基因中影响泌乳性状较多的一个基因,牛GHR基因位于20号染色体，由10个exon和9个子intron组成，基因序列SNP突变会使该基因结构和功能发生改变，从而影响信号转导及该基因介导的生长激素(growth hormone，GH)基因的生理效应[1]，最终使泌乳、生产等经济性状发生改变。将牛GHR基因作为候选基因，研究该基因与泌乳、生产性能的关系，对牛的育种具有重大实践意义[2]。国内外大量研究发现，GHR基因第8exon T/A替换，使其编码的氨基酸呈现F279Y转换，显著影响牛的泌乳性能[3-7]。也有研究表明，GHR基因部分外显子多态产生的不同基因型对乳脂率[8、9]、乳蛋白百分含量[10]有影响。本研究对青海泽库高原型牦牛GHR基因部分片段进行了SNP多态性检测，结合乳成分数据分析了该SNP多态对乳成分的影响，旨在为下一步针对牦牛乳选育提高提供一定的分子遗传学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物来自青海省泽库县某牧场，采集32头(胎次为2～3胎，年龄为6～7岁，产犊时间为当年4月底到5月初)泌乳牦母牛颈静脉血样5mL，干冰运往实验室，-20℃冷冻保存。

1.2 基因组DNA提取

基因组DNA提取采用柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(生工)。提取后DNA采用分光光度计检测浓度和纯度。

1.3 引物序列及PCR反应程序

PCR引物设计参照NCBI 中登录号为AM161140.1序列。

表1 牦牛GHR基因片段 1、2、exon 8 扩增引物序列

PCR反应体系：DNA模板2μL，引物F、R 各2μL，dNTP 2μL，10×Taq buffer 5μL，Taq酶 0.5μL，加ddH2O至50μL。

PCR反应条件：95℃预变性4min；94℃变性30 sec，55℃退火30sec，72℃延伸50 sec；35 cycle，72℃修复延伸6 min。

1.4 PCR产物回收测序

PCR产物切胶后经PCR产物回收试剂盒回收后冷冻，冷冻样品干冰送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及检测SNP。

1.5 乳成分数据测定

乳样采集时间为7月底纯放牧条件下，采集50ml泌乳牦母牛奶样干冰运往实验室，用超声波乳品分析仪检测乳脂肪、乳蛋白、非脂乳固体、密度、冰点、盐、电导率。

1.6 数据分析

数据统计软件采用IBM SPSS Statistics 22，分析各乳成分的平均值和标准偏差及SNP产生不同基因型组各乳成分差异显著性。

2 结果与分析

2.1 牦牛GHR基因部分片段PCR扩增结果

引物1扩增片段1长度为635bp，引物2扩增片段2长度为772bp，引物3扩增Exon 8片段长度为470bp。

2.2 牦牛GHR基因部分片段SNP多态性检测结果

本试验所有样本中未发现片段1、exon 8 SNP多态性，片段2发现多态位点1个，第82位T。

2.3 CC型和CT型各乳成分平均值比较

CC型和CT型占比为3∶1，CT型各乳成分含量平均值比CC型较高。CC基因型和CT基因型两组平均数采用配对样本T检验法比较差异显著性，结果表明，不同基因型间冰点值P<0.05，说明CC基因型和CT基因型间冰点值差异显著，CC基因型冰点值显著高于CT型，CC型为该群体优势基因型。其它乳成分不同基因型间差异不显著。

表2 不同基因型间牦牛乳成分均值及差异显著性比较

3 讨论与结论

(1)对中国荷斯坦牛GHR基因第8 exon F279Y位点SNP与泌乳性能的相关性研究发现，该SNP与305d泌乳量、乳脂率和乳蛋白率显著相关[11]。马彦男等[12]研究表明，该位点突变形成的AA基因型305d泌乳量显著高于AT基因型，而AT基因型在305d乳脂量、305d乳蛋白含量和305d乳糖量高于AA基因型，等位基因A对高产奶量有正效应，等位基因T对乳成分有正效应，并表明该F279Y突变可针对性应用于中国荷斯坦牛泌乳性状的标记辅助选育中。然而在本试验中未发现牦牛GHR基因第8 exon F279Y位点突变，可能是样品数量较少的原因，该位点在牦牛群体中是否存在突变有待进一步研究。

(2)生乳冰点是衡量生乳中是否添加水的重要指标之一[13]。20世纪初，冰点被正式应用于牛乳中掺水鉴定[14]，检测仪器最早利用Hortvet冰点仪进行[15]。随着科技的发展，现在已研制出多种冰点仪[16]。鉴于冰点仪在技术上的持续优化、奶牛饲养管理、挤奶方式、产奶量等变化，普通牛乳中正常冰点值范围也一直是研究热点。20世纪60年代 Stubbs[17]、Dahlberg[18]、Hortvet测定的普通牛乳冰点均值低于-0.540℃，20世纪90年代各国研究冰点值范围为-0.530～-0.520℃[19]，现在普遍认同的荷斯坦牛乳冰点均值为-0.525～-0.521℃[20]。研究表明[21]品种差异、个体差别、季节变化、乳房炎、饲养管理条件等因素均会影响牛乳冰点值。目前对冰点值的研究大多局限于普通荷斯坦牛乳，有关牦牛乳冰点值方面的研究报道极为罕见。对牦牛乳冰点值也没有统一标准可参考，且各地方品种和类群牦牛间乳成分差异较大，研究牦牛乳的冰点值能为今后牦牛生鲜乳收购标准的制定提供重要的理论依据。研究表明牦牛乳冰点与乳糖、乳蛋白、非脂乳固体呈极显著负相关[22]。该结论与李玲等[23]对水牛乳冰点值与滴定酸度、蛋白质、脂肪、总固形物以及乳糖+灰分总量存在极显著负相关性的结论相同。

(3)有关牦牛GHR基因对泌乳性能影响的研究报道极为少见，对该基因的研究仅限于该基因在牦牛不同组织中的表达及对生长性状影响的研究[24]。对麦洼牦牛GHR基因SNP多态性研究发现第5exon存在一个SNP位点，该SNP位点形成3种基因型TT/TC/CC，TT基因型管围极显著高于TC和CC基因型，TC和CC基因型差异不显著，CC为优势基因型[25]。本试验所测片段2SNP位点产生的CC基因型冰点值显著高于CT基因型，CC型为该群体优势基因型。再结合冰点与其它乳成分的极显著相关性，是否可由此针对性的开展分子育种有待进一步研究。