外源因子调控卵母细胞体外成熟的研究进展

孙铭菊，屈佳丹，郇延军

（青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

体外受精（in vitro Fertilization，IVF）、体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）以及胚胎冷冻保存（Embryo Cryopreservation，EC）等胚胎工程技术的兴起及应用极大促进了畜牧业发展，这些胚胎工程技术的进步离不开高质量成熟的卵母细胞。研究表明，卵母细胞在成熟过程中，尤其是在体外环境下，容易受到各种外源因子的影响，这些外源因子能够调控卵母细胞成熟，决定卵母细胞成熟质量和在胚胎工程技术中的应用效果。但哪些或哪类外源因子在卵母细胞成熟过程中发挥主要作用，以及这些外源因子如何发挥作用影响卵母细胞成熟还没有详细概述，而且改善卵母细胞成熟质量的外源因子，尤其是抗氧化物质，尚未有效开发，同时，最新研究技术，尤其是单细胞多组学测序（Single-Cell Multi-Omics Sequencing）技术，尚未指出在外源因子调控卵母细胞成熟机理研究中的发展空间。为此，本文概述了外源有害因子和有利（抗氧化）因子对卵母细胞成熟质量的影响，指出开发健康有效提高卵母细胞成熟质量的外源因子的重要性，探讨了外源因子调控卵母细胞成熟机理的最新研究方法，为创新和完善卵母细胞体外成熟培养体系提供了研究思路，进而提高动物生殖健康和加快胚胎工程技术的应用。

1 卵母细胞体外成熟及其研究意义

卵母细胞成熟需经历2 次减数分裂过程，在体外成熟培养条件下，处于第一次减数分裂前期双线期的卵母细胞在卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）、促黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH）等激素刺激下，发生生发泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），恢复减数分裂，最终停滞在第二次减数分裂中期（MII），并排出第一极体，即核成熟；在卵母细胞核成熟过程中，细胞质也发生了一系列形态变化来完成胞质成熟，涉及细胞器的重新空间定位和母源物质的储备利用等。

研究发现，体外成熟卵母细胞的发育能力低于体内成熟的卵母细胞，这可能归因于体外成熟卵母细胞的核成熟和胞质成熟不充分。卵母细胞在体外成熟过程中，不健全的培养体系会致使卵母细胞成熟质量下降，而且各种外源因子也会作用于卵母细胞，调控卵母细胞成熟及后续发育能力。因此，通过对这些外源因子深入研究，充分揭示外源因子调控卵母细胞成熟的分子机制，将会创新和完善卵母细胞体外成熟培养体系，提升卵母细胞成熟质量，促进胚胎工程技术的广泛应用。

2 外源因子调控卵母细胞成熟

目前，科研人员通过改变培养体系确定了大量影响卵母细胞成熟的外源因子，其中外源有害因子和有利（抗氧化）因子受到广泛关注。

2.1 外源有害因子分类 外源有害因子即环境污染物，涉及降低卵母细胞成熟质量的物质（表1）。根据外源有害因子属性，主要分为物理类、化学类和生物类。物理类有害因子包括热应激（Heat Stress）、各种辐射（Radiation）等。化学类有害因子是最广泛存在的，涉及日常所接触的塑化剂（Plasticizer）、除草剂（Herbicide）、重金属（Heavy Metal）等。生物类有害因子主要是食物霉变所产生的毒素（Toxin）或感染的细菌、病毒及寄生虫分泌的有害物质等。

表1 外源有害因子损伤卵母细胞成熟的潜在调控作用

2.2 外源有害因子影响卵母细胞成熟的潜在作用机制

2.2.1 物理类有害因子 卵母细胞在生长成熟过程中对温度极为敏感，热应激会给卵母细胞成熟造成严重损伤。热应激可降低成熟卵母细胞母源物质的储备，同时破坏缝隙连接，下调热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）和线粒体DNA 编码的相关基因表达，致使ATP含量降低，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平增加，凋亡信号通路激活，此外，热应激还会破坏纺锤体组装，降低卵母细胞成熟。

包括手机辐射、紫外线、-射线在内的各种辐射也会干扰卵母细胞成熟。手机辐射会造成超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽过氧化物酶（）和过氧化氢酶（）的活性和总体抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，TAC）下降，脂质过氧化物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平升高，致使卵母细胞成熟降低。紫外线辐射也会使卵母细胞线粒体分布出现异常，拷贝数下降。此外，-射线会诱导线粒体膜电位丢失，抑制卵母细胞成熟。

2.22 化学类有害因子 化学类有害因子广泛存在，如塑化剂、除草剂、除虫剂、重金属等均对卵母细胞成熟具有明显毒性。

邻苯二甲酸酯（Phthalic Acid Ester，PAE）是邻苯二甲酸形成的酯的统称，常被用作增塑剂。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）-phthalate，DEHP）及其代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯（Monoethylhexyl Phthalate，MEHP）已被证明会损伤卵母细胞成熟。DEHP 及MEHP 会破坏卵母细胞皮质颗粒、内质网和线粒体的定位，改变线粒体膜电位，紊乱氧化磷酸化基因表达，同时下调母源基因表达，损伤线粒体功能，降低ATP 含量，增加ROS 水平，破坏纺锤体组装和染色体排列，造成DNA 损伤，触发凋亡，以及改变表观遗传修饰（DNA 甲基化、H3K9me3 和H3K9ac），降低卵母细胞成熟。双酚A（Bisphenol A，BPA）同样作为增塑剂和内分泌干扰物，可降低卵母细胞成熟。BPA 可破坏线粒体、内质网和溶酶体的分布及功能，延迟减数分裂进程，提高ROS 水平，触发自噬和凋亡，而且紊乱纺锤体组装和染色体排列，改变表观遗传修饰（H3K4me2 和DNA 甲基化）水平，损伤卵母细胞成熟。

草甘膦（Glyphosate，GLY）是一种广泛使用的有机磷类除草剂，严重危害动物生殖健康。研究表明，GLY 会抑制卵母细胞GVBD 发生，下调和基因表达，破坏线粒体分布和膜电位，提高ROS水平，破坏纺锤体结构，造成DNA 损伤和凋亡，降低卵母细胞成熟，另外，GLY 也会影响卵母细胞类固醇类物质生成，破坏卵母细胞成熟。

镉（Cd）和铅（Pb）等重金属也会给卵母细胞带来损伤。镉暴露会紊乱卵母细胞细胞周期蛋白（）表达和成熟促进因子（）活性，提高ROS 水平，引发DNA 损伤和凋亡，而且破坏纺锤体组装和染色体排列，造成染色体非整倍体，同时下调DNA 甲基化、组蛋白H3K9me3 和H3K9ac 水平，损伤卵母细胞成熟。铅也具有生殖毒性，铅可破坏线粒体分布，降低和酶活性，上调ROS 和MDA 水平，同时下调谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平，并通过信号通路干扰卵母细胞成熟。

2.2.3 生物类有害因子 霉菌毒素（Mycotoxin）是霉菌在其污染的食物中产生的有毒代谢物，常见的有赭曲霉素A（Ochratoxin A，OTA）、HT-2 毒素、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等，严重危害动物生殖健康。其中，OTA 破坏线粒体功能，降低ATP 含量，提高ROS 水平，诱发凋亡，同时，紊乱纺锤体组装和染色体排列，改变DNA 甲基化、DNA 羟甲基化、H3K9ac和H3K9me3 水平，破坏卵母细胞成熟。HT-2 提高卵母细胞ROS 水平，破坏纺锤体形态，诱导凋亡和自噬，同时，也会增加DNA 甲基化、H3K4me2 和H3K9me2水平，降低卵母细胞成熟质量。

动物感染的病毒也会破坏卵母细胞成熟质量。例如，牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）干扰类固醇类性激素合成，致使卵母细胞成熟质量下降。戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）也会促进卵母细胞凋亡。

3 外源有利因子对卵母细胞成熟的影响

3.1 外源有利因子与抗氧化 外源有利因子主要指可改善卵母细胞成熟质量的培养基添加物（表2）。目前的卵母细胞体外成熟培养体系是基于下丘脑-垂体-卵巢轴（Hypothalamic-Pituitary-Ovarian Axis，HPOA）激素调控基础上，添加卵泡液（Follicular Fluid，FF）、表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、半胱氨酸（Cysteine，CYS）等抗氧化因子建立。近年来，研究发现，外源有害因子主要是通过氧化应激损害卵母细胞成熟。为此，从外源因子中开发抗氧化剂，降低氧化损伤，成为提高卵母细胞成熟研究的热点之一。目前，褪黑激素（Melatonin，MT）、天然酚类化合物、维生素、微量金属元素等具有抗氧化功能的物质已被应用到卵母细胞体外成熟培养体系中，改善了卵母细胞成熟。

表2 外源抗氧化因子改善卵母细胞成熟的潜在调控作用

3.2 外源抗氧化因子调控卵母细胞成熟的潜在作用机制

3.2.1 褪黑激素调控卵母细胞成熟的作用机制 MT 是一种吲哚杂环类化合物，可调控HPOA 激素分泌，是目前最强的内源性自由基清除剂，呈现出强大的抗氧化功能。卵母细胞体外成熟过程中添加MT 可以改善线粒体分布和膜电位，提高GSH 含量，降低ROS 水平和凋亡，增强自噬，同时改善DNA 甲基化、DNA 羟甲基化、H3K9 整体乙酰化、H3K9 甲基化、H3K27 乙酰化以及H4K16 乙酰化等表观遗传修饰，促进纺锤体组装和染色体排列，提高卵母细胞成熟，还可降低内质网压力促进卵母细胞成熟。此外，MT 能够缓解外源有害因子对卵母细胞造成的损伤。例如，MT 可以保护卵母细胞免受热应激导致的ROS 水平升高、GSH含量下降、凋亡以及纺锤体组装紊乱，挽救DEHP及MEHP 导致的卵母细胞氧化损伤、凋亡、自噬以及紊乱的纺锤体组装、DNA 甲基化和H3K4me2，还能降低BPA、GLY、OTA 等诱导的卵母细胞ROS 水平、凋亡、自噬以及纺锤体组装和染色体排列紊乱，以及下调镉诱导的内质网压力，改善卵母细胞成熟。可见，MT 可以增强线粒体功能，减少氧化应激、内质网压力及凋亡，调控自噬，改善纺锤体组装、染色质排列以及表观遗传修饰，提高卵母细胞成熟。

3.2.2 天然酚类化合物调控卵母细胞成熟的作用 天然酚类化合物通常包括类黄酮化合物和非类黄酮化合物，均具有抗氧化活性。槲皮素（Quercetin，QUR）是一种具有多种生物活性的类黄铜酚类化合物，能够有效清除自由基，可保护卵母细胞免受氧化损伤。研究发现，QUR 能够改善线粒体活性，降低ROS 水平，抑制凋亡，改善卵母细胞成熟质量。在热应激条件下，QUR 能减少颗粒细胞凋亡，维持卵母细胞成熟质量。可见，QUR 能够有效改善线粒体功能，抑制凋亡，提高卵母细胞成熟质量。白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种非类黄酮酚类化合物，同样具有抗氧化功能。研究表明，RES 可改善S和基因表达，提高GSH 和ATP 含量，降低ROS 和凋亡水平，促进卵母细胞成熟。在热应激条件下，RES 也能够增强表达，提高GSH 含量，降低ROS 水平，增强卵母细胞成熟。RES 还能保护卵母细胞免受杀菌剂代森锰锌诱导的凋亡。可见，RES 可改善线粒体功能，降低氧化损伤和凋亡，提高卵母细胞成熟质量。总之，天然酚类化合物具有抗氧化功能，改善卵母细胞成熟。

3.2.3 维生素对卵母细胞成熟的影响 维生素是一类必须从外界获得维持机体正常生理功能所需的微量有机物质，包括维生素A、维生素B、维生素C 等，也具有很好的抗氧化活性。维生素C 能够降低ROS 水平，改善表观遗传修饰相关基因表达，擦除DNA 甲基化和H3K27me3 以及建立H3K4me3 和H3K36me3，促进卵母细胞成熟，还能减轻BPA 对卵巢的毒性。此外，维生素B可提高卵母细胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相关基因表达。可见，维生素能够有效防控氧化损伤，减少凋亡，改善表观遗传修饰，促进卵母细胞成熟。

3.2.4 微量元素对卵母细胞成熟的调控作用 微量元素（硒、锌、铜等）在卵母细胞成熟中也发挥抗氧化作用。硒可提高卵母细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力，降低颗粒细胞DNA 损伤。锌能提高卵母细胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相关基因表达，还可抑制内质网压力，增强卵母细胞成熟质量。

当然，还有众多极有潜力的抗氧化物质可改善卵母细胞成熟。目前，寻找新的清除自由基的抗氧化物质，并开发健康有效的抗氧化成分是现代生殖健康研究领域的一个重要发展方向。同时，在卵母细胞体外成熟过程中，抗氧化物质的抗氧化机理、是否具有协同作用以及能否有效拮抗有害因子也需进一步研究。

4 小结与展望

卵母细胞成熟是一个复杂的动态调控过程，外源因子可直接或间接作用于卵母细胞，影响卵母细胞成熟，但外源因子如何作用于卵母细胞，调控哪些关键基因表达以及外源抗氧化因子如何拮抗有害因子发挥改善卵母细胞成熟作用目前还没有明确答案。

最近几年，单细胞多组学测序技术的兴起和应用，可以更加精确地阐明外源因子在卵母细胞成熟过程中的作用。单细胞转录组和蛋白组测序能够明确外源因子调控的卵母细胞成熟关键基因，表观遗传修饰组学测序可以从表观遗传修饰角度指出外源因子通过哪些修饰调控卵母细胞成熟关键基因表达，以及染色质可接近性测序更能精确反映外源因子对卵母细胞染色质开放性的调控，进而通过转录因子调控卵母细胞成熟关键基因表达。当然，卵母细胞成熟是一个精密的调控过程，其调控机理尚未完全阐明，外源因子在卵母细胞成熟过程中的作用也未充分揭示。为此，外源因子调控卵母细胞成熟机理已成为生命科学生殖领域的一个研究重点。相信，随着卵母细胞研究新技术的发展和外源因子调控卵母细胞成熟机理的阐明，卵母细胞体外成熟培养体系将更加健全，卵母细胞成熟率和成熟质量将得到更大提高，更能有效促进胚胎工程技术在畜牧业中的广泛应用。