非编码RNA ANRIL CNV-2738282增加中国南方人群肺动脉高压的易感性

李惠波 段跃兴 赖晓纯 冯燕玲 黄莲枝 陈钦修 程宏基 郑栋 伍金雷 程颖 黄冰生 林桂雄 吴钰燕 张鹏 李国扬 曾庆春 卓裕丰

广州市番禺区何贤纪念医院1心内科，3呼吸内科（广州511400）；2广州医科大学附属第二医院肾内科（广州510260）；4南方医科大学南方医院心内科（广州510515）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PAH）是一种发病机制复杂的血管疾病，其主要特征为肺血管阻力增加和血管压力持续增高［1-3］。目前对PAH 发病相关机制尚不清楚。而有研究显示单核苷酸多态等基因遗传变异与PAH 发生有着密切的关联［4-6］。而基因组DNA 拷贝数变异（copy-number variations，CNVs）是近年来新发现的遗传变异形式，且CNVs 更易引起基因的结构异常或表达变化［7］。已有研究显示染色体9p21.3 区段是血管疾病的遗传热区［8］，而ANRIL（antisense non coding RNA in the INK4 locus）在此染色体位点功能中发挥重要作用［9］。但是关于PAH 与ANRIL 的研究国内外鲜有报道。本研究基于文献报道和生物信息学分析，拟探索位于血管疾病遗传热区9p21.3 的长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）ANRIL 的CNVs 与PAH 疾病发生的关系，以期找出适合评价PAH 发病、诊断的遗传分子标记。

1 资料与方法

1.1 样本资料本研究共纳入在2015年1月至2018年12月期间就诊于番禺区何贤纪念医院和南方医科大学南方医院的PAH 患者587 例，还有736 例年龄和性别匹配的健康对照者也在同一时期的体检项目中登记。通过右心导管测定所有患者的血液动力学，若平均肺动脉压≥25 mmHg 而肺毛细血管楔压正常，则可诊断为PAH［10］。

1.2 研究方法

1.2.1 CNV 选择、基因型及LncRNA ANRIL 靶基因表达检测生物信息学分析发现LncRNA ANRIL（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home），本研究中只检测CNV-2738282 基因型，并分析其与PAH 的关联。收集150 对PAH 病例和健康对照新鲜静脉血样本，采用实时荧光定量PCR 法检测LncRNA ANRIL及其靶基因在PBMC 标本中的表达水平、ANRIL 在细胞核和胞浆的表达。

1.2.2 LncRNA ANRIL 的生物学表型检测将pcDNA3.1-ANRIL 和pcDNA3.1 空白质粒分别转染至EAhy926 细胞，转染6 h 后换液培养，G418 药物筛选稳定表达细胞系。进行单核细胞粘附实验、单核细胞跨上皮细胞迁移实验和血管内皮细胞迁移实验。

1.2.3 荧光素酶报告基因实验细胞接种于24孔板，当细胞汇合度达80%～90%时，将LipofectamineTM3000 与CARD8 启动子报告基因质粒和pcDNA3.1-ANRIL 或pcDNA3.1 空白质粒共转染加入各培养孔，14～16 h 后分别检测萤光素酶和内参海肾荧光素酶活性。

1.2.4 ChIRP实验使用Magna ChIRPTMChromatin Isolation by RNA Purification Kit 试剂盒（Millipore，马萨诸塞州，美国）进行ANRIL 对CARD8 基因转录调控的机制探讨。实验依照试剂操作说明进行，最后洗涤、分离并纯化RNA 和DNA 后应用qRT-PCR 法进行检测。

1.2.5 RNA-pull down 实验委托上海生工生物工程公司体外合成ANRIL 片段以及截断的突变RNA 序列ANRIL-Mut 作为参照，并以T7 RNA polymerase 转录为ANRIL RNA 片段。用亲和素锚定磁珠收集RNA-蛋白质复合物，对复合物进行Western blot 验证。

1.3 统计学方法应用R 软件（版本3.0.2）进行统计和分析。使用χ2检验、logistic 回归模型，独立样本t检验分析在病例对照组间比较的差异，及其在不同基因型之间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNV-2738282 与人群肺动脉高压的发病显著相关利用TaqMan 拷贝数分型方法，检测PAH 病例和健康对照的CNV-2738282 的拷贝数。CNV-30795 的基因型与人群PAH 发病存在显著关联，且相较于2-copy 常见基因型携带者，≤1-copy 基因型携带者发生PAH 的风险显著降低（OR= 0.41，95%CI：0.32～0.52）。进一步分层分析显示（表2），CNV-2738282 与PAH 发病的风险在年龄、性别、吸烟、饮酒等亚组间差异均有统计学意义；因样本量小，CNV-2738282 与PAH 发病的关联在有PAH家族史亚组中差异无统计学意义。此外，未观测到CNV-2738282 与上述环境因素在PAH 发病风险上存在显著的交互效应。见表1。

表1 CNV-2738282 与PAH 之间危险因素相关性Tab.1 Correlation of risk factors between CNV-2738282 and PAH 例（%）

表2 通过PAH 和对照组中的选择变量对CNV-2738282 基因型进行分层分析Tab.2 Analysis of CNV-2738282 genotype by PAH and the selection variables in the control group 例（%）

2.2 CNV-2738282低拷贝导致ANRIL表达降低采用qPCR 法检测PAH 外周血PBMCs ANRIL 基因的表达水平，发现ANRIL 的表达水平在不同CNV-2738282 基因型PBMCs 间存在显著差异，携带≤1-copy 基因型的PAH 患者中ANRIL 表达水平显著低于2-copy 基因型的患者（P＜0.001，图1）。

图1 CNV-2738282 基因型与ANRIL 表达的关系Fig.1 The relationship between CNV-2738282 genotype and ANRIL expression

2.3 ANRIL 在PAH 病例中呈高表达水平qPCR法检测了150 对PAH 和健康对照外周血PBMCs ANRIL 的表达水平，发现ANRIL 在60.7%（91/150）的病例PBMCs 中的表达高于健康对照者，差异有统计学意义（P＜0.001，图2A）。

2.4 ANRIL 与CARD8 表达相关基于物信息学分析LncRNA ANRIL 可能通过与靶基因CARD8 启动子区结合而调控其表达，继而在PAH 外周血检测了CARD8 基因的表达，发现两者表达呈正相关（r= 0.354，P＜0.001，图2B）。并且，CARD8 在PAH 病例外周血的表达高于健康者，差异有统计学意义（P= 0.002，图2C）。此外，过表达ANRIL的血管内皮细胞系相较于对照细胞系，其CARD8的表达显著上调（图2D）。

2.5 ANRIL 通过Trans-acting 机制在转录水平影响CARD8 的表达亚细胞定位实验显示ANRIL主要在胞核表达，提示其可能在转录水平参与基因表达调控（图2E）。生物信息学分析显示ANRIL 可通过结合CARD8启动子区而调控CARD8的表达，故通过构建CARD8 启动子荧光素酶报告基因，将报告基因和pcDNA3.1-ANRIL 或空载体共转染血管内皮细胞系；过表达ANRIL 能明显上调CARD8 基因的转录水平（图2F）。ChIRP 实验结果证实，ANRIL 可与CARD8 基因启动子特异性结合（图2G、H）。RNA Pull-down 实验结果则显示，在蛋白水平ANRIL 未与CARD8 蛋白特异性结合。上述结果提示ANRIL 是通过特异性结合CARD8 基因启动子而参与CARD8 的转录调控（图2I）。

图2 ANRIL 与CARD8 表达的关联及其分子Fig.2 The relationship between ANRIL and CARD8 expression and its molecules

2.6 ANRIL 介导的细胞生物学表型变化见图3，相较于对照细胞系，过表达ANRIL 能显著促进THP-1 细胞对血管内皮细胞EA.hy926 的黏附和定植能力；此外，过表达ANRIL 的EA.hy926 细胞的迁移能力亦明显增加。

图3 ANRIL 过表达对血管内皮细胞的生物学功能影响Fig.3 The effect of ANRIL overexpression on the biological function of vascular endothelial cells

3 讨论

PAH 是一种进行性致死性血管疾病，其特征是肺动脉压升高，血管重塑［11］，并最终导致右心室心力衰竭［12-13］。而有证据表明LncRNAs 变异在PAH 发病机制中扮演着重要的角色［14-15］。但是关于ANRIL CNVs与PAH关系的研究至今鲜有报道。

CNVs 可直接造成位于该区段的基因拷贝数发生变化，影响基因表达水平，导致表型差异［16］，已成为目前研究的热点之一。YANG 等［17］研究发现携带BMPR2 变异的PAH 患者临床上表现为肺动脉血流动力受阻及心功能受损。本研究发现ANRIL 在PAH 病例中表达水平增多，同时ANRIL与CNV-2738282 表达成正相关，提示ANRIL 表达水平越高，PAH 发病风险升高。

近年来发现ANRIL 参与心血管疾病的发病机制是通过调节基因的表达。LU 等［18］研究发现ANRIL 基因型rs10757278 调节CARD8 促进心血管疾病发生。而CARD8 也参与肺部疾病的发病机制［19-21］。本研究发现PAH 患者中ANRIL、CARD8表达呈正相关，而且ANRIL 与CARD8 特异性结合基因启动子而参与CARD8 的转录调控。利用生物功能分析表明，ANRIL 是通过特异性结合CARD8 基因启动子影响血管内皮细胞的各项功能。

经查阅国内外文献，暂未发现国内外ANRIL拷贝数分布差异的相关报道，因此也遗憾的未能进一步研究。综上，本研究在国内较先发现ANRIL CNV-2738282 与我国人群PAH 发病存在显著关联，该CNV 通过调控ANRIL 的表达，影响ANRIL 对下游靶基因CARD8 的转录激活，继而影响PAH 疾病的发生，可作为人群PAH 易感评估的生物标志物。