3D 打印支架联合iPSCs-NSCs 对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及运动功能的影响

李长明 邓小梅 周化腾 全仁夫

脊髓损伤一直是困扰医学界的难题，常见于高处坠落、交通外伤，且呈现发病率高、致残率高的特点，常造成损伤平面以下的感觉、运动丧失，甚至瘫痪[1]。据不完全统计，中国有超过100 万的脊柱脊髓损伤患者，且以每年12 万的速度增长，不仅给患者带来严重的身心负担，同时也给家庭和社会形成了沉重的经济负担[2]。目前关于修复受损神经的研究越来越多，其中种子细胞+生物支架疗法被证实可以有效促进脊髓损伤的修复[3-4]，但是其机制不明了，且细胞来源受到伦理学限制，难以扩大应用范围。因此，本实验采用人尿液来源重编程诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）并分化为神经干细胞（neural stem cells，NSCs）吸附于3D 打印支架上，移植于脊髓受损区域，观察其对大鼠运动神经元凋亡及运动功能的影响，并探讨其可能的机制。

1 实验材料

1.1动物 选用雄性SD 大鼠42 只，SPF 级，体质量200～250g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供[许可证号：SCXK（湘）2019-0004]，给予足量的水和饲料，环境温度23～25℃，相对湿度40%～60%，明暗光照12h/12h，分笼饲养。本研究经伦理委员会审核，对动物处置方法符合相关伦理要求[伦理审查号：20170625182365]。

1.2主要试剂与仪器 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（批号P133293）购于美国sigma 公司；山羊抗兔B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗体（批号BS1511）、山羊抗兔Bcl 相关X 蛋白（Bax）多克隆抗体（批号BS1725）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批号BS7004）均购于美国Bioworld 公司；原位末端转移酶标记法（TUNEL）试剂盒（批号11684817910）购于中国罗氏生物公司。仪器包括荧光显微镜（型号CKX53）购于日本Olympus 公司；3D 打印机（型号Bio-Architect-Pro）购于中国杭州捷诺飞生物科技有限公司；可控性皮质损伤撞击仪（型号mode6.3）购于美国Custom Design 公司；手术器械购于中国江苏鱼跃医疗设备股份有限公司。

2 实验方法

2.1支架细胞预处理 将预先制备的3D 支架[5]截成2～3mm 的小段，置于干细胞培养基中浸泡48h后，在无菌操作台中风干，灭菌备用。按前期实验方法制备人来源iPSCs[6]，并分离鉴定，并向NSCs 分化，将iPSCs-NSCs 细胞培养至第7 天时，消化计数，将1×106个细胞浓缩为0.2mL，滴于预处理过的支架上，置于培养箱中2h 后用于实验模型制备与术后处理。

2.2实验设计与分组 42 只SD 大鼠（SPF 级）按照随机数字表法分为三组，每组14 只。采用改良Allen's 法通过可控性皮质脊髓撞击仪构建脊髓损伤模型[7]。术后分笼饲养，37℃恒温下保温，每天以crede 手法按压排尿3 次，预防泌尿系统感染，术后3天以每天2 次的频率腹腔注射相同剂量庆大霉素（8mg/kg）预防感染。1 周后进行实验。麻醉后于T9-T10节段去除椎板，三组均切除损伤处脊髓2～3mm，给予不同干预措施。假手术组：只打开椎板；模型组：制作脊髓损伤模型，植入DMEM 培养液0.2mL；iPSCs-NSCs 组：植入载iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架预处理。模型成功标准[8]：术后即刻大鼠出现痉挛性摆动，摆尾反射、双下肢迟缓性瘫痪，术后2h 进行Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）评分评估小鼠后肢运动能力，BBB 评分为0 分时，则模型构建成功。

2.3后肢运动功能恢复的行为学评估 在术后1、3、7、14、28 天，将大鼠放入开口箱子，轻敲箱壁，使其爬行，观察动物运动距离，臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况，每只大鼠观察15min，对各组大鼠的运动能力进行BBB 评分测试，评估采取双盲法，由熟悉BBB 评分量表的实验人员进行。

2.4苏木精-伊红（HE）染色检测脊髓损伤程度 各组动物均于干预8 周后处死，经40g/L 多聚甲醛心脏灌注固定取脊髓组织样本（T9-T10节段），PBS 清洗后置于40g/L 多聚甲醛中固定，再行脱水、包埋、切片等步骤，行HE 染色，镜下观察各组脊髓瘢痕和空洞面积，评价脊髓损伤程度。

2.5免疫组化检测Bax、Bcl-2 变化 每只大鼠取3张切片，按SP 试剂盒说明书测定Bcl-2、Bcl-2 相关性死亡蛋白（Bad）、Bax 的表达，常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理、高温修复、血清封闭、滴加一抗过夜（浓度为1∶150），并同时用PBS 代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜、隔日滴加二抗孵育20min、SABC 37℃孵育20min，继而DAB 显色，镜下观察显色背景。以上各步骤间均用0.01mol/L PBS 漂洗3 次，每次5min，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察脊髓组织变化。

2.6RT-PCR 检测Caspase-3 mRNA 表达 采用RNA 自旋试剂盒说明书方法抽提总RNA。反转录体系含4μL DNAse 处理过的RNA、Buffer 5μL、1μL dNTPs（10μM）、1μL Oligo （dT）、0.5μL 随机引物（100μM）、1μL MMLV 逆转录酶（200U/μL）、8.5μL DEPC H2O，共20μL。然后按以下条件进行反转录反应。30℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃ 5min。取出后在0.2mL PCR 管内，依次加入1μL 反转录产物（RT 产物），各基因上游与下游引物各0.25μL，12.5μL PCR 反应mix（Taq 酶，Taq buffer，dNTPs），用ddH2O 补足体积至25μL。按以下条件进行反转录反应，94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃/55℃/48℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，扩增35 个循环。用one-Dscan 图像分析软件分析目标条带的灰度值。

从GenBank 获得目的基因mRNA 的全长序列，利用引物和探针设计软件Primer 5.0 设计引物序列。经过Blast 分析，引物序列具有特异性。所用的引物及内参照β-actin 引物见表1。引物均委托南昌中洪博元生物有限公司合成。

2.7统计学方法 应用SPSS 16.0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用t 检验，P＜0.05 差异有统计学意义。

3 结果

3.13D 打印支架联合iPSCs-NSCs 促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复 手术前所有大鼠BBB 评分均为21 分。假手术组因未损伤脊髓，术后BBB 评分均为21 分。术后1、3 天，模型组和iPSCs-NSCs 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。术后7、14、28 天，模型组和iPSCs-NSCs 组大鼠双下肢运动功能均得到一定程度的恢复（P＜0.05），iPSCs-NSCs 组较模型组恢复更好（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠BBB 评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠BBB 评分比较（分，±s）

注：假手术组不做处理；模型组植入DMEM 培养液0.2mL；iPSCs-NSCs 组植入载iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架预处理；iPSCs 为诱导性多能干细胞；NSCs 为神经干细胞；BBB 评分为Basso，Beattie and Bresnahan 行为评分法；与同组术后1 天比较，aP＜0.05；与同组术后3 天比较，bP＜0.05；与模型组同期比较，cP＜0.05

3.23D 打印支架联合iPSCs-NSCs 促进脊髓损伤大鼠脊髓神经元修复 干预28 天后，HE 染色显示假手术组脊神经生长良好；模型组脊神经受到损伤，组织水肿，细胞稀疏，细胞之间的间隙增大；iPSCs-NSCs 组细胞生长较模型组紧密，各组织生长间隙缩小，空泡减小，组织水肿消失。见图1。

图1 各组大鼠脊髓组织HE 染色结果（HE 染色×100）

3.33D 打印支架联合iPSCs-NSCs 抑制脊髓损伤大鼠凋亡相关蛋白表达 免疫组化染色切片上，免疫阳性染色呈棕褐色。免疫组化结果显示，在脊髓损伤后28 天，iPSCs-NSCs 组Bcl-2 阳性细胞的表达较模型组多（P＜0.05）；iPSCs-NSCs 组Bax 阳性细胞的表达较模型组少（P＜0.05）。见图2、表3。

表3 各组大鼠脊髓组织Bcl-2、Bax 阳性表达比较（个/mm2，±s）

表3 各组大鼠脊髓组织Bcl-2、Bax 阳性表达比较（个/mm2，±s）

注：假手术组不做处理；模型组植入DMEM 培养液0.2mL；iPSCs-NSCs 组植入载iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架预处理；iPSCs 为诱导性多能干细胞；NSCs 为神经干细胞；Bcl-2 为B 淋巴细胞瘤-2；Bax 为Bcl 相关X 蛋白质；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

图2 各组大鼠脊髓神经组织Bcl-2 和Bax 阳性表达情况（免疫组化×100）

RT-PCR 结果显示，脊髓损伤术后28 天，iPSCs-NSCs 组Caspsase-3 mRNA 表达量较模型组少（P＜0.05），较假手术组无明显改变（P＞0.05）。见图3、表4。

表4 各组大鼠脊髓组织Caspase-3 mRNA 表达量比较（±s）

表4 各组大鼠脊髓组织Caspase-3 mRNA 表达量比较（±s）

注：假手术组不做处理；模型组植入DMEM 培养液0.2mL；iPSCs-NSCs 组植入载iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架预处理；iPSCs 为诱导性多能干细胞；NSCs 为神经干细胞；Caspase-3 为半胱氨酸蛋白酶-3；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

图3 各组大鼠受损节段脊髓组织Caspase-3 mRNA 表达情况

4 讨论

随着组织工程学的发展，种子细胞+生物支架疗法因其类似于体内正常组织中细胞-细胞外基质间的动态相互作用，被越来越多地用于脊髓损伤修复研究[9-10]。张仁坤等[3]研究证实，3D 打印支架载NeuroDl 修饰的NSCs 能够促进脊髓损伤大鼠神经环路的重建，对运动和感觉功能恢复有促进作用。曹宗锐等[4]利用胶原-硫酸肝素支架联合神经干细胞，促进大鼠脊髓损伤处神经纤维的再生，改善大鼠双侧后肢运动功能。本研究通过3D 打印支架联合iPSCs-NSCs 治疗脊髓损伤大鼠，发现28 天后，iPSCs-NSCs组BBB 评分高于模型组（P＜0.05），且28 天后脊髓组织病理切片显示iPSCs-NSCs 组细胞生长较模型组紧密，各组织生长间隙缩小，空泡减小，组织水肿消失，说明该方法能促进脊髓损伤后大鼠感觉和运动功能的恢复，但是其机制还需要进一步探讨。

脊髓功能丧失主要是由继发改变引起的，在损伤急性期通过减轻或消除继发性病理变化、保护残存的轴突和神经元不再遭受二次损伤，是目前关于脊髓损伤治疗研究的重点[11]。脊髓损伤主要是由于损伤后水肿的发生，激活一系列分子和细胞机制，引发炎症反应等，最终导致细胞的凋亡和坏死。运动神经元细胞凋亡影响运动功能的恢复。有研究表明，Bcl-2、Bax 蛋白和Caspase-3 在脊髓损伤后神经细胞的凋亡中发挥关键性作用[12]。Bcl-2 是凋亡抑制因子，能够抑制或有效阻止脊髓损伤后各种途径引起的细胞凋亡，促进受损神经组织的修复。Bax 是凋亡促进因子，脊髓损伤后可刺激Bax 蛋白使线粒体膜的通透性发生变化，诱导神经细胞凋亡。Caspase-3 是凋亡执行因子，其表达水平可一定程度上反映细胞凋亡的情况。本研究结果表明，iPSCs-NSCs 组Bcl-2 阳性细胞表达明显增加，Bax 阳性细胞和Caspase-3 mRNA 表达明显减少，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明3D 打印支架联合iPSCs-NSCs干预可使脊髓损伤大鼠Bcl-2 表达上调，Bax 和Caspase-3 表达下调，因而有效抑制神经细胞凋亡。

脊髓损伤后局部胶质瘢痕形成，上下行神经传导束中断，微环境受损及神经元细胞凋亡、坏死造成脊髓不可逆性恢复，本研究中采用3D 打印支架替换受损脊髓，不仅为中断的神经环路提供了“桥梁”，而且3D 打印支架是中空多孔的结构，为上下行传导束重建和轴突生长提供通道并除去物理隔离，对改善其物理微环境有着积极的作用。NSCs 是一种多能干细胞，有永久的增殖能力及分化多向性，可改善受损神经元细胞，是理想的种子细胞。NSCs 移植能够抑制神经细胞凋亡，改善受损神经元神经功能缺失[13-14]。本文采用人尿液细胞提取、分化成NSCs，不仅无创，费用低，且有效避免了伦理学的限制。

综上所述，3D 打印支架联合iPSCs-NSCs 可明显恢复脊髓损伤大鼠运动功能，其原因可能为3D 打印支架为中断的神经环路提供了“桥梁”，NSCs 改善了受损脊髓微环境，其具体机制可能与上调Bcl-2表达及下调Bax、Caspase-3 表达，从而降低脊髓神经元细胞凋亡相关。