五味子乙素对CCl4 诱导的肝损伤大鼠NF-κB/COX-2 的影响

孙惠萍 王 剑 张小芳

肝纤维化损伤是各种新陈代谢、病毒和毒性刺激引起的肝脏急性或慢性损伤，最终会导致肝硬化和各种并发症，如门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌等[1]。目前肝纤维化损伤发生发展机制尚不明确。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一种转录因子，控制参与多种生物过程，抑制NF-κB 信号通路可改善肝纤维化损伤[2-3]。在NF-κB 靶基因中，环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）可促进包括肝细胞癌和肝纤维化在内的炎性疾病发生[4-5]。因此，抑制NF-κB 和COX-2 可能是肝损伤的潜在治疗策略。五味子乙素是五味子的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保肝等多种药理活性[6-7]。研究表明，五味子乙素通过多种调节机制减轻四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导的肝损伤[1]。本研究探讨五味子乙素对CCl4诱导大鼠肝损伤的保护作用及其可能机制。

1 实验材料

1.1动物 雄性SPF 级Wistar 大鼠18 只，体质量（180±20）g，购自北京维通利华有限公司，动物合格证号：201907005，许可证号：SYXK（浙）2018-0017。本实验通过浙江省温州市温州医科大学伦理委员会审核，伦理审批号：WYDW2019-0232。所有大鼠在恒定温度（18～25℃）、湿度（40%～70%）和12h明/12h 暗循环的环境中，自由饮水和进食，饲养1周以适应环境。

1.2细胞 人肝癌HepG2 细胞系（批号HB-8065）购于美国模式培养物保存中心（ATCC）。

1.3主要试剂及仪器 Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS，批号61870044）购自美国Gibco 公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批号257621） 购自Sigma 公司，五味子乙素（批号1910028）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，CCl4（批号40006861）和橄榄油（批号69018028）购自国药集团化学试剂有限公司。NF-κB（批号sc-8008）、COX-2（批号sc-376861）和β 肌动蛋白（β-actin，批号sc-8432）购自美国Santa Cruz 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠二抗（批号#7076）购自美国Cell Signaling 公司。苏木精-伊红（HE，批号20190517）试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司）。细胞计数-8（CCK-8）试剂盒（批号20190414）、BCA 蛋白质分析试剂盒（批号20190405）、增强型ECL 化学发光试剂（批号20190528）、碱性磷酸酶（ALP，批号20190115）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号20190517）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST，批号20190606）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。倒置光学显微镜（型号：AI09）购自日本奥林巴斯公司。酶标仪（Multiskan MS 型） 购自美国Thermo Scientific 公司，紫外可见分光光度计（UV-2800）购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1细胞培养及细胞活力测定 人肝癌HepG2 细胞系在含有10% FBS 的DMEM 中培养，置于37℃的5%CO2环境下。使用CCK-8 测定法来测量HepG2 细胞活力，将细胞以每孔5×103个细胞接种在96 孔板中，并将细胞暴露于不同浓度（0、5、10、20、40 和80μM）五味子乙素24h。然后，将细胞与10μL CCK-8 在37℃下再孵育1h。使用酶标仪在450nm 下测量。

2.2五味子乙素的抗氧化活性 采用DPPH 自由基清除活性测量五味子乙素的抗氧化活性。采用文献[8]方法测定五味子乙素对DPPH 自由基的清除作用，称取DPPH 10mg，95%乙醇配制成0.2mmol/L 溶液备用。五味子乙素配制不同浓度（50、100、150 和200μM） 样品溶液备用。50μL 样品溶液和50μL DPPH 溶液加到96 孔板中，在避光处静置30min，UV-VIS 分光光度计于517nm 处测定其吸光值（Ai）。同一条件下，乙醇＋样品溶液的吸光度为Aj，DPPH溶液+乙醇的吸光度为A0。DPPH 自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，实验重复3 次。

2.3动物分组及给药 18 只大鼠根据随机数字表法分为对照组、模型组和五味子乙素组，每组6 只。模型组和五味子乙素组大鼠每周3 次腹腔注射溶于橄榄油（20%，2mL/kg）的CCl4处理，持续8 周以诱导肝损伤。8 周后五味子乙素组每天予50mg/kg 五味子乙素灌胃，对照组和模型组每天给予等体积0.9%氯化钠溶液，持续4 周。末次处理后，颈脱位处死，收集大鼠肝脏和血清样品用于生化和分子分析。

2.4组织学分析及肝功能指标检测 将肝组织在10%甲醛中固定，石蜡包埋切片（厚度3μm），并将其安装在载玻片上。将切片用HE 染色，通过倒置光学显微镜成像。使用比色法检测大鼠血清AST、ALT 和ALP 含量。

2.5蛋白质印迹 根据制造商的说明，使用裂解缓冲液试剂盒从肝脏组织和HepG2 细胞中制备总蛋白，并使用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。在SDS-PAGE 凝胶上分离总蛋白，电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭1h。将膜与一抗在4℃孵育过夜，一抗包括NF-κB、COX-2 和βactin（1∶1000），TBST 溶液洗膜3 次，加入抗鼠二抗在室温下孵育1h，使用ECL 试剂进行显像，条带灰度值通过Image J 软件进行分析，β-actin 为内参。

2.6统计学方法 应用SPSS 20.0 进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（±s），采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD 事后检验确定组间差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1不同浓度五味子乙素的抗氧化活性 五味子乙素的抗氧化活性随浓度增加而增强（P＜0.05），见表1。

表1 不同浓度五味子乙素的抗氧化活性（%，±s）

注：DPPH 为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；与50μM 组比较，aP＜0.05；与100μM 组比较，bP＜0.05；与150μM 组比较，cP＜0.05

3.2不同浓度五味子乙素抑制HepG2 细胞活力五味子乙素（40 和80μM）处理可降低HepG2 细胞活力，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表2。

表2 不同浓度五味子乙素对HepG2 细胞活力影响（%，±s）

表2 不同浓度五味子乙素对HepG2 细胞活力影响（%，±s）

注：与0μM 组比较，aP＜0.05；与40μM 组比较，bP＜0.05

3.3三组大鼠体质量、肝脏重量和肝指数比较 与对照组比较，模型组大鼠体质量降低，肝脏重量和肝指数显著升高（P 均＜0.05）。与模型组比较，五味子乙素组大鼠体质量升高，肝脏重量和肝指数降低（P均＜0.05）。见表3。

表3 三组大鼠体质量、肝脏重量和肝指数比较（±s）

表3 三组大鼠体质量、肝脏重量和肝指数比较（±s）

注：对照组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝损伤模型大鼠，予生理盐水；五味子乙素组为肝损伤模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.4三组大鼠肝组织肝功能比较 对照组大鼠肝细胞具有正常结构，没有明显炎症迹象，在模型组中观察到炎性细胞浸润，提示五味子乙素处理可明显减轻CCl4引起的损害（见图1）。与对照组比较，模型组大鼠血清ALP、ALT、AST 水平均升高（P 均＜0.05）。与模型组比较，五味子乙素组血清ALP、ALT、AST 水平降低（P 均＜0.05），见表4。

图1 三组大鼠肝组织病理切片（苏木精-伊红染色×100）

表4 三组大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比较（U/L，±s）

表4 三组大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比较（U/L，±s）

注：对照组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝损伤模型大鼠，予生理盐水；五味子乙素组为肝损伤模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；ALP 为血清碱性磷酸酶；ALT 为丙氨酸氨基转移酶；AST 为天冬氨酸氨基转移酶；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.5各组体外和体内NF-κB 和COX-2 蛋白表达水平比较 体外实验中，20、40μM 五味子乙素显著降低细胞NF-κB 和COX-2 的蛋白表达（见图2A、表5，P＜0.05）。体内实验中，与对照组比较，模型组大鼠肝组织NF-κB 和COX-2 蛋白表达增强（P＜0.05）。与模型组比较，五味子乙素组NF-κB、COX-2 蛋白表达减弱（P＜0.05），见图2B、表6。

图2 各组体外和体内NF-κB 和COX-2 的蛋白表达

表5 不同浓度五味子乙素对外HepG2 细胞NF-κB和COX-2 蛋白表达的影响（±s）

表5 不同浓度五味子乙素对外HepG2 细胞NF-κB和COX-2 蛋白表达的影响（±s）

注：NF-κB 为胞核因子-κB；COX-2 为环氧化酶-2；与0μM 组比较，aP＜0.05

表6 三组大鼠肝组织NF-κB 和COX-2 蛋白表达水平比较（±s）

表6 三组大鼠肝组织NF-κB 和COX-2 蛋白表达水平比较（±s）

注：对照组为健康大鼠，予生理盐水；模型组为肝损伤模型大鼠，予生理盐水；五味子乙素组为肝损伤模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；NF-κB 为核因子-κB；COX-2 为环氧化酶-2；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

4 讨论

炎症是免疫系统针对各种有害刺激（如病原体、毒素、辐射和创伤、有毒化学物质、矿物质和抗原）的自然保护机制[9]。但是，持续性急性炎症可能会导致心血管、肝脏、代谢类疾病和癌症[10]。本研究表明，在CCl4诱导的肝损伤模型中，使用五味子乙素可降低肝癌HepG2 细胞活力、炎性介质NF-κB 和COX-2的表达以及血清ALT、AST 和ALP 的水平，同样，形态学检查证实，五味子乙素处理可减少模型组炎症细胞浸润并改善肝损伤。这些结果表明，五味子乙素可以有效保护肝脏免受CCl4毒性的影响，其机制可能与其对炎症通路NF-κB/COX-2 的抑制作用有关。

肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等肝病的发生发展与自由基密切相关[8]。本研究通过使用DPPH 自由基清除活性来证实五味子乙素的体外抗氧化功效。CCl4因在动物和人类中表现出相似的病理变化，已被用作建立肝损伤实验模型[3，11]。研究表明，使用CCl4会增加炎症细胞因子，破坏免疫系统和淋巴器官，从而导致慢性炎症性肝纤维化[3]。此外，本研究中CCl4增加了血清ALP、AST 和ALT 水平，反映肝损伤的程度[12-13]。而五味子乙素治疗降低了这些酶的水平，表明五味子乙素可减轻CCl4诱导的肝损伤并改善肝功能。

NF-κB 在肝脏中产生促炎性细胞因子，并调控免疫应答，继而引起肝病，是炎症的主要调节剂[3]。CCl4诱导肝损伤大鼠肝组织NF-κB 及IκBα 蛋白表达[12]，而五味子乙素处理可显著抑制CCl4诱导的NF-κB 活化。抑制NF-κB 诱导的促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、COX-2 和基质金属肽酶的活化，可以改善肝功能。因此，阻断NF-κB/COX-2 途径的激活可以阻止炎症介质在肝脏疾病中的募集。此外，本研究中五味子乙素降低了CCl4诱导的COX-2 活化，从而减少炎症，坏死和纤维化。研究表明，五味子乙素能抑制NF-κB 活化及炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）来对抗炎症损伤[14]，且对巨噬细胞中脂多糖诱导的炎症具有保护作用，主要通过抑制一氧化氮和PGE2 的产生及NF-κB 通路表达[15]。

综上所述，体外实验五味子乙素可降低体外肝癌细胞活力以及炎性介质NF-κB 和COX-2 表达，在体内，五味子乙素降低CCl4诱导的肝损伤大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平及炎性介质NF-κB 和COX-2 表达，减少炎症细胞浸润，改善肝损伤，表明五味子乙素可能通过抑制NF-κB/COX-2 信号传导途径减轻炎症，从而减轻肝损伤发展。