基于网络药理学探究1-脱氧野尻霉素治疗2 型糖尿病作用机制

李俊峰 吴力超 王 进 孙腾飞 赵俊慧 张婷婷 刘文洪

糖尿病是一组因胰岛素绝对或相对分泌不足和（或）胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢紊乱性疾病。根据国际糖尿病联合会2019 年最新报告，到2045 年，糖尿病患者将从2019 年的4.63 亿增加到7 亿，其中，90%左右为2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。目前T2DM 的常规口服治疗药物有磺脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂类，但可能出现低血糖、胃肠道反应等不良反应。

中药及其提取物在内的天然活性产物，以其资源丰富、作用温和、毒副作用小而被用于治疗T2DM，逐渐成为研究热点[2]。桑叶具有良好的降血糖、降血脂等作用，广泛用于治疗糖尿病、肥胖症等疾病[3]。1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑叶中的主要生物碱（含量为0.3%），被认为是关键的生物活性物质。Li 等[4]建立糖尿病小鼠模型，发现经DNJ 治疗后小鼠空腹血糖水平、胰岛素敏感性都得到显著改善，同时DNJ 加速肝葡萄糖代谢。体外实验研究发现，桑叶中DNJ 可以促进成熟3T3-L1 细胞对葡萄糖的吸收来调节葡萄糖稳态[5]。目前已经证实DNJ 是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，对糖尿病显示出良好的生物活性，但大部分学者集中在探讨其对血糖、血脂、相关酶活的比较，而具体作用机制尚未深入[6]。本研究拟借助网络药理学方法，研究药物、靶点、通路之间的网络关系，旨在为阐明DNJ 治疗T2DM 的作用机制提供理论参考。

1 资料与方法

1.1数据库 PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 网 站（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Genecard 数据库（https://www.genecards.org/）；OMIM 数据库（https://omim.org/）；Draw Venn Diagram 网站（http://bioin formatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/）；STRING11.0 数据库（https://string-db.org/）；Metascape 数据库（http://metascape.org）。

1.2DNJ 潜在靶点获取 利用DNJ 的CAS 号（19130-96-2）从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得DNJ 的SDF 文件，将SDF 文件导入SwissTargetPrediction 网站[7]（http://www.swiss targetprediction.ch/），设置属性为“Homo sapiens”，进行靶点预测，获取DNJ 的潜在靶点。

1.3T2DM 相关靶点收集 以“2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）”为关键词输入到Genecard数据库[8]（https://www.genecards.org/）和OMIM 数据库[9]（Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）检索获得T2DM 治疗靶点。

1.4药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建 使用Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/）对T2DM 治疗靶点和DNJ 潜在靶点进行分析，获取药物与疾病的共同靶点，绘制韦恩图（Venn），这些共同靶点代表DNJ 治疗T2DM 的潜在作用靶点。利用STRING11.0 数据库[10]（https://string-db.org/）构建共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI） 网络，将生物种类设定为“Homo sapiens”，其余均为默认设置。用Cytoscape 3.7.2软件可视化药物与疾病共同靶点的PPI 网络。

1.5核心靶点分析 使用Cytoscape 3.7.2 软件的插件Cytohubba 和MCODE 挖掘DNJ 作用于T2DM 的PPI 网络核心靶点[11]。Cytohubba 是Cytoscape 软件中寻找核心靶点的一个插件，用于发现复杂网络中的关键目标[12]。利用Draw Venn Diagram（http://bioinfor matics.psb.ugent.be/Webtools/venn/） 对Cytohubba 得出的结果进行分析，得到的重叠靶点即为核心靶点。Molecular Complex Detection（MCODE）可以将基因网络中的关键靶点模块提取出来，发现PPI 网络中相互作用的密集区域，即各聚集的模块，默认选择得分前二的模块作为分析对象，从而找出核心靶点[13]。Cytohubba 和MCODE 的参数均为默认设置。

1.6GO 和KEGG 富集分析 利用Metascape 数据库[14]（http://metascape.org）将获取的DNJ 治疗T2DM的所有潜在靶点进行生物信息学在线分析，包括基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以P＜0.01 为标准，筛选出显著性GO 富集项目及靶点参与的关键通路信息。应用R 语言软件对以上分析结果可视化。同时将药物、靶点、通路信息导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建DNJ 治疗T2DM 的“药物-靶点-通路”网络。

2 结果

2.1DNJ 和T2DM 潜在靶点获取 利用SwissTargetPrediction 网站对DNJ 进行靶点预测，共获得100个潜在靶点（见图1A）。通过Genecard 数据库与OMIM 数据库检索，去除重复值，共获得T2DM 疾病相关靶点5381 个（见图1B）。

图1 潜在靶点获取

2.2共同靶点PPI 网络构建 绘制Venn 图，结果表明，通过匹配100 个药物靶点和5381 个疾病靶点，筛选出72 个共同靶点（见图2A），即DNJ 治疗T2DM 的潜在靶点。基于STRING11.0 数据库得到共同靶点的PPI 网络，互作网络中有71 个节点（剔除一个游离节点）和245 条边，节点代表DNJ 与T2DM的共同靶点，边代表靶点间的互作关系。其中，节点越大，颜色越深，该节点与其他节点的连接数量越多，表示该节点在整个网络中的贡献度（degree）越大，即该靶点与其他靶点互作频次高，说明药物与其有较高的结合活性，PPI 网络图中重要靶点包括PTGS2、MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2等（见图2B）。

图2 DNJ 与T2DM 共同靶点PPI 网络图

2.3核心靶点分析结果 Cytohubba 分析获得MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 共7个核心靶点（见图3A）。MCODE 分析获得了得分最高的两个模块，得分分别为7.067 和4.000。模块1 和模块2 包含了从Cytohubba 分析中获得的7 个核心靶点，这进一步证实MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 的重要性（见图3B）。

图3 CytoHubba 和MCODE 分析核心靶点

2.4GO 富集分析结果 通过Metascape 数据库对DNJ 治疗T2DM 的潜在靶点进行GO 分析，富集结果显示，具有生物学过程406 条，分子功能99 条，细胞成分72 条，根据P 值大小各筛选出前10 条展示（见图4）。由图可知，涉及到的主要生物学过程（molecular function）包括化学突触传递（chemical synaptic transmission）、顺行突触信号（anterograde transsynaptic signaling）、碳水化合物代谢过程（carbohydrate metabolic process），参与的分子功能（molecular function）主要包括水解O-糖基化合物酶活性（hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、碳水化合物结合（carbohydrate binding）、葡萄糖苷酶活性（glucosidase activity）等，主要细胞成分（cellular component）有突触（presynapse）、突触膜（synaptic membrane）、轴突（axon）等。

图4 DNJ 治疗T2DM 靶点的GO 富集分析结果（前10 条）

2.5KEGG 富集分析结果 KEGG 通路分析结果表明，DNJ 治疗T2DM 主要集中在46 条信号通路中（P＜0.01）。根据P 值大小筛选出前10 条KEGG 通路，利用R 语言软件绘制气泡图（见图5）。由图可知，72 个靶点主要富集在神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、cAMP 信号通路（cAMP signaling pathway）、半乳糖代谢（galactose metabolism）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）等，表明DNJ 可通过多条通路的协调作用发挥治疗T2DM 作用。

图5 KEGG 通路分析气泡图

利用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-靶点-通路网络（见图6），发现核心靶点MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 富集在重要通路包括神经活性配体-受体相互作用、cAMP 信号通路、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、其他聚糖降解等。

图6 药物-靶点-通路网络图

3 讨论

为探讨DNJ 治疗T2DM 的可能作用机制，本研究利用SwissTargetPrediction 网站、Genecard 数据库、OMIM 数据库获得DNJ 治疗T2DM 的潜在作用靶点72 个，Cytoscape 3.7.2 软件对作用靶点的PPI 网络图可视化分析，发现重要靶点包括PTGS2、MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA、DRD2 等；使用Cytoscape 3.7.2 软件的Cytohubba 和MCODE 插件挖掘DNJ 作用于T2DM 的PPI 网络的核心靶点，共筛选出7 个核心靶点，包括MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2，与PPI 网络可视化分析结果一致。其中，MGAM 是一种α-葡萄糖苷酶消化酶，它通过在非还原端水解线性α（1→4）葡萄糖低聚物或糊精来催化淀粉消化的关键末端反应，并在血液中释放葡萄糖[15]。MGAM 在调节餐中葡萄糖稳态中起着至关重要的作用[16]。CNR1 与肥胖症和血脂异常有关[17]，并且已有研究发现CNR1 活性的调节在糖尿病及其并发症中起重要作用[18]。GLA（α-galacto-sidase）和GLB（β-galactosidase）在糖尿病动物肾脏中的浓度较低，这可能是高血糖症的结果[19]。另有研究报道，miR-26a 和miR-26b 通过下调SI 的表达来达到糖尿病治疗的目的[20]。β-D-mannosidase（MANBA）与糖尿病相关，并且糖尿病患者血清中MANBA 活性显著降低[21]。DRD2 等位基因在T2DM 患者中似乎非常普遍，对饮食、体重和血糖控制的潜在影响值得进一步探讨[22]。以上结果表明，MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2 可能是DNJ 治疗T2DM的潜在作用靶点。

最后通过GO 和KEGG 富集分析，发现DNJ 治疗T2DM 主要涉及化学突触传递、顺行突触信号、碳水化合物代谢过程等生物学过程，通过调节神经活性配体-受体相互作用、cAMP 信号通路、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等发挥T2DM 治疗作用，并且通路中关键靶点涉及MGAM、CNR1、GLA、GLB1、SI、MANBA 和DRD2，结果与筛选的核心靶点亦相同。由此预测DNJ 主要通过作用上述生物过程及信号通路来治疗T2DM。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，预测DNJ 治疗T2DM 的分子机制具有多靶点、多通路的特点，为后续实验验证提供研究思路，同时从机制上为T2DM 的防治提供新思路和新方法。