基于HPLC 指纹图谱的宣肺止咳合剂传统汤剂与配方颗粒汤剂成分对比研究

王 莹 何 潆 周晓霞 刘丽琴

中药传统汤剂是我国应用最早、最广泛的剂型[1-2]。然而其贮存不易、携带不便等缺点，严重制约了其在临床上的应用和发展。中药配方颗粒是由单味中药饮片经提取、浓缩、制粒、分装等现代制药技术制成[3]，用于临方调配成汤剂，即配方颗粒汤剂。其在保持传统汤剂随证加减优势的前提下，改进了传统汤剂的绝大多数弊端，在一定程度上推动了剂型改革创新，促进了中医药发展。但自其试点二十多年以来，并未得到业界共识和有效推广，根本原因就是配方颗粒汤剂和传统汤剂的等效性问题未获根本解决；此外，中药配方颗粒尚无统一的质量标准，造成其质量参差不齐，限制配方颗粒剂的发展[4-5]。宣肺止咳合剂（又名清肺饮）是浙江大学医学院附属杭州市胸科医院治疗上呼吸道感染、肺炎等病的经验方，由麻黄、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蚕、石膏七味药组成，具有清热宣肺，止咳平喘的功效，在临床中使用多年，疗效显著[6]。本实验通过获取其传统汤剂与配方颗粒指标成分含量及HPLC 特征图谱，比较二者在化学成分方面的差异，为传统汤剂的改革及配方颗粒的科学合理应用奠定基础。

1 实验材料

1.1试药 宣肺止咳合剂传统汤剂所用中药饮片：麻黄（批号180127）、葛根（批号190727）、苦杏仁（批号191205）、知母（批号190715）、甘草（批号191009）、僵蚕（批号190724）、石膏（批号190807）由浙江惠松制药有限公司提供，经我院副主任中药师周晓霞鉴定合格；中药配方颗粒：9 批麻黄配方颗粒（A 厂3 批，批号191001、191003、191004，B 厂3 批，批号1907604、1907608、1903613，C 厂3 批，批号19086302、19076016、19066312）、9 批葛根配方颗粒（A 厂3 批，批号190903、190905、190906，B 厂3 批，批号1907604、1907608、1907608，C 厂3 批，批号19076394、19097016、19097322）、9 批苦杏仁配方颗粒（A 厂3 批，批号190610、190611、190612，B 厂3批，批号1908503、1908506、1908507，C 厂3 批，批号19065385、19065527、19065617）、9 批知母配方颗粒（A 厂3 批，批号190601、190603、190604，B 厂3 批，批号7115907、7115982、7115993，C 厂3 批，批号19066334、19066454、19066587）、9 批甘草配方颗粒（A 厂3 批，批号191001、191005、191008，B 厂3 批，批号1908603、1908607、1908610，C 厂3 批，批号19095214、19095416、19095517）、9 批僵蚕配方颗粒（A 厂3 批，批号190605、190702、190706，B 厂3 批，批号8011282、8011290、8011376，C 厂3 批，批号19066515、19066617、19066738）、9 批石膏配方颗粒（A 厂3 批，批号190801、190806、190807，B 厂3 批，批号1909501、1909503、1909602，C 厂3 批，批号19076714、19076832、19076938）；葛根素对照品（批号110752-20181612，中国食品药品检定研究院，含量以95.4%计）；大豆苷对照品（批号111738-201603，中国食品药品检定研究院，含量以93.3%计）；甘草酸铵对照品（批号110731-201418，中国食品药品检定研究院，含量以93.1%计）。

1.2仪器及试剂 Thermo Fisher U3000 高效液相色谱仪（DAD 二极管阵列检测器）；AL204 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；KQ-500DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。乙腈（德国默克公司，色谱纯）；甲醇和甲酸（杭州试剂公司，分析纯）；实验用水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相：0.1%甲酸水（A）、乙腈（B），梯度洗脱程序：0～25min，10%～20%B；25～40min，20%～40%B；40～45min，40%～95%B；45～48min，95%B；48～49min，95%～10%B；49～53min，10%B，柱温30℃，检测波长254nm，进样量5μL，流速1.0mL/min。

2.2样品制备

2.2.1传统汤剂制备 按宣肺止咳合剂处方比例分别称取麻黄50g、苦杏仁78g、石膏422g、知母118g、甘草78g、葛根118g、僵蚕78g，加入药材用量的8 倍水量，浸泡30min，煎煮2 次，第1 次1h，第2 次30min，滤过，合并煎液浓缩至1000mL，即得，同法制备3 批。

2.2.2配方颗粒汤剂制备 取相当于麻黄5g、苦杏仁7.8g、石膏42.2g、知母11.8g、甘草7.8g、葛根11.8g、僵蚕7.8g 的A、B、C 厂配方颗粒（各3 批）置100mL 量瓶中，加温水使溶解并定容至刻度，混匀，即得。

2.3供试品溶液制备 取“2.2.1”项下3 批传统汤剂，3 批A 厂、3 批B 厂及3 批C 厂配方颗粒汤剂各25mL，分别置于50mL 量瓶中，加50%甲醇适量，超声提取30min，冷却至室温，加50%甲醇至刻度，经0.45μm 微孔滤膜过滤，即得。传统汤剂3 批以及3厂家各3 批配方颗粒汤剂分别标记为S1～S12。

2.4对照品溶液制备 分别精密称取葛根素、大豆苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇溶解分别配制成每1mL 含葛根素1852.0μg、大豆苷450.0μg、甘草酸铵612.0μg 的混合对照品溶液。

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验 精密吸取S2 供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，连续6 次，记录色谱图。结果各主要共有特征峰的相对保留时间无明显变化，RSD 在0.03%～0.24%；相对峰面积RSD 在0.42%～3.59%，葛根素、大豆苷、甘草酸铵的保留时间的RSD 值分别为0.06%、0.22%、0.16%，峰面积的RSD 值分别为3.19%、2.65%、3.06%，表明仪器精密度良好。

2.5.2稳定性试验 精密吸取S2 供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24h 进样，按“2.1”项下色谱条件测定。结果各主要共有特征峰的相对保留时间无明显变化，RSD 在0.08%～0.36%；相对峰面积RSD在0.71%～4.42%，葛根素、大豆苷、甘草酸铵的保留时间的RSD 值分别为0.17%、0.12%、0.21%，峰面积的RSD 值分别为3.27%、1.26%、3.68%，表明供试品在24h 内稳定性良好。

2.5.3重复性试验 取同一批传统汤剂样品（S2），按“2.3”项下的方法，制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结果各主要共有特征峰的相对保留时间无明显变化，RSD 在0.04%～0.68%；相对峰面积RSD 在0.15%～2.46%，葛根素、大豆苷、甘草酸铵的保留时间的RSD 值分别为0.21%、0.43%、0.36%，峰面积的RSD 值分别为1.99%、1.43%、2.51%，表明方法重复性良好。

2.5.4线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液2、4、5、6、8、10mL，分别置10mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列浓度的混合对照品溶液。取10μL 注入液相色谱仪，测定峰面积值，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X）进行线性回归，结果葛根素对照品溶液回归方程为Y=4.1621X-0.0744，r=1.0000，线性范围为370.4～1852.0μg/mL，大豆苷对照品溶液回归方程为Y=4.3559X+0.074，r=0.9999，线性范围为90～450.0μg/mL，甘草酸铵对照品溶液回归方程为Y=0.795X+0.0414，r=0.9999，线性范围为122.4～612.0μg/mL。

2.5.5加样回收率试验 精密量取已测定指标成分量的传统汤剂样品（S2）0.50mL 共6 份，分别精密加入混合对照品溶液1.0mL，加50%甲醇定容至25mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，并计算回收率。结果葛根素、大豆苷、甘草酸的平均回收率分别为99.2%、98.8%、99.6%，RSD 分别为1.0%、0.8%、0.9%。

2.7指纹图谱建立及共有峰确定

2.7.1指纹图谱采集 分别精密吸取“2.3”和“2.4”项下对照品溶液和各供试品溶液，按照“2.1”项下建立的色谱条件进样测定，分别记录3 批传统汤剂及3厂家3 批配方颗粒汤剂的HPLC 指纹图谱。

2.7.2指纹图谱建立 将12 批样品的色谱图依次导入国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 版A）》，构建HPLC 指纹图谱，共标示出共有峰28 个，通过与对照品保留时间及紫外吸收光谱图比对，指认了9 号峰葛根素、12 号峰大豆苷、26 号峰甘草酸铵，结果见图1。

图1 混合对照品色谱图（A）和宣肺止咳合剂不同样品匹配色谱图（B）（9-葛根素12-大豆苷26-甘草酸）

2.8指纹图谱比较

2.8.1化学成分种类和数目比较 通过指纹图谱峰数的比较，传统汤剂中的23 号峰在配方颗粒3 厂家中均不存在；传统汤剂中的26 号峰的峰面积均比配方颗粒3 厂家小；9 号峰在B 厂家和C 厂家中峰面积较小。综上所述，3 种配方颗粒汤剂及传统汤剂在化学成分的种类和数目上存在一定的差异。

2.8.2共有峰总峰面积比较 以3 批传统汤剂色谱图中所有共有峰总峰面积的均值定为1，采用归一化法求得其他供试品共有峰总峰面积的相对值。结果显示4 类供试品（传统汤剂、A、B、C 厂配方颗粒）中各共有峰峰面积总和比值分别为1.00、1.02、0.67、0.59，说明A 厂配方颗粒各成分含量的总和最接近传统汤剂，B、C 厂配方颗粒各成分含量的总和均低于传统汤剂。

2.8.3指标性成分含量比较 取3 批传统汤剂，3 批A 厂、3 批B 厂及3 批C 厂配方颗粒汤剂，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定指标性成分的含量。运用t 检验评价配方颗粒汤剂供试品中葛根素、大豆苷、甘草酸铵含量与传统汤剂的差异（见图2）。由图2 可知，不同供试品中葛根素含量的排序为A 厂配方颗粒汤剂＞传统汤剂＞B 厂配方颗粒汤剂＞C 厂配方颗粒汤剂，而大豆苷含量的排序为传统汤剂＞A 厂配方颗粒汤剂＞B 厂配方颗粒汤剂＞C 厂配方颗粒汤剂，甘草酸铵含量的排序为B 厂配方颗粒汤剂＞C 厂配方颗粒汤剂＞A 厂配方颗粒汤剂＞传统汤剂。

图2 宣肺止咳合剂不同样品中葛根素、大豆苷、甘草酸铵含量的比较（n=3）

2.8.4指纹图谱的相关性 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）》对传统汤剂、3 厂家配方颗粒供试品的特征图谱相关参数进行评价，设定参照图谱，将色谱峰自动匹配，生成对照图谱（R，平均值法），并进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。结果显示，3 厂家配方颗粒与传统汤剂相似度均大于0.95，相似度较高。整体上，A 厂的相似度略高于B 厂和C 厂。见表1。

表1 相似度计算结果

2.8.5主成分分析 主成分分析法（PCA）是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法。近年来，主成分分析法被越来越多应用于中药质量评价中[9]。本研究通过对3 批传统汤剂及3 厂家3 批配方颗粒汤剂指纹图谱特征峰的峰面积进行PCA 分析，结果显示，第一主成分（PC1）的累积贡献率为97.02%，第二主成分（PC2）的累积贡献率为1.08%，其他累积贡献率可忽略不计。3 批传统汤剂及3 厂家3 批配方颗粒汤剂被划分在不同的区域范围，区分效果明显。见图3。

图3 3 批传统汤剂与3 厂家3 批配方颗粒汤剂的PCA 得分图（A）和载荷图（B）

3 讨论

3.1色谱条件的选择 预实验比较了等度洗脱和梯度洗脱，等度洗脱各成分分离度小，所以选择梯度洗脱。对不同梯度洗脱系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液）进行了比较，结果以乙腈-0.1%甲酸水溶液系统分离度较好，基线较平稳，能够满足指纹图谱对色谱峰的要求。采用光电二极管阵列检测器（DAD）于190～400nm 波长进行扫描，结合色谱峰个数和强度综合考察，结果表明主要成分在254nm 波长处有最大吸收且吸收峰较多，可较全面地体现样品的图谱特征。

3.2指标性成分的确定 宣肺止咳合剂中君药麻黄主要含有生物碱，预实验未找到合适的色谱条件进行定量分析，臣药葛根及佐使药甘草在全方发挥了重要作用，葛根的主要成分包括异黄酮类、三萜类化合物、生物碱类等，异黄酮类主要有葛根素、大豆苷等；葛根素和大豆苷，具有抗炎、抗氧化应激、抗过敏、改善血循环等作用[7]，甘草的主要化学成分以三萜皂苷类和黄酮类为主，三萜类化合物中最主要的是就是甘草酸，具有解毒、抗炎、镇咳等药理作用[8]。故选择葛根中的葛根素、大豆苷以及甘草中的甘草酸这3 种成分作为指标性成分。

3.3指标性成分含量分析比较 通过对比传统汤剂和3 厂家配方颗粒汤剂指标性成分的含量测定结果发现，葛根素在传统汤剂中的含量明显低于A 厂家配方颗粒汤剂的含量，高于B、C 厂家配方颗粒汤剂的含量，大豆苷在传统汤剂中的含量明显高于配方颗粒汤剂中的含量，而甘草酸铵在传统汤剂的含量明显低于配方颗粒汤剂的含量。传统汤剂与配方颗粒指标成分含量有极显著差异，提示临床用药时应以传统汤剂为参考标准，结合传统汤剂的成分、药性特点以及患者情况等进行全面权衡，合理确定给药剂量[9]。3 厂家配方颗粒汤剂的指标成分含量有显著差异，除原料因素和制剂工艺因素外，缺乏统一的质量控制标准也是重要的原因。

3.4指纹图谱分析比较 指纹图谱技术能全面反映中药饮片或制剂的内在化学特征，指纹图谱技术已成为控制中药质量的最有效手段[10-11]。本研究通过比较传统汤剂及3 厂家配方颗粒汤剂的指纹图谱，结果表明传统汤剂和配方颗粒在化学成分的种类、数目和含量上均有一定的差异，汤剂的化学成分种类稍多，其含量因化学成分不同而有升有降。表明中药复方煎煮过程中，会因成分之间增溶、氧化、水解、还原等反应的发生，导致一些成分含量的变化，甚至产生新的化学成分[12-13]。相关性分析结果表明，传统汤剂与3 厂家配方颗粒汤剂的相似度均大于0.95，相似度较高。说明他们所含化学成分间的比例与传统汤剂差异较小。共有峰总峰面积对比分析结果表明，A 厂配方颗粒各成分含量的总和最接近传统汤剂，B、C 厂配方颗粒各成分含量的总和均低于传统汤剂，与相似度分析结果一致。

综上所述，本实验通过全面对比传统汤剂及配方颗粒的差异，表明传统汤剂的化学成分种类稍多，配方颗粒相对较少，其指标成分的含量有升有降，表明传统汤剂与配方颗粒在化学成分及含量上均有一定差异，应当对中药配方颗粒的临床推荐用量进行校正，促进临床合理应用。本实验仅从体外化学成分层面对其进行对比，其入血成分及药效层面需进一步深入探讨，以获取更全面的差异规律。