桃叶珊瑚苷对人结肠癌HT-29 细胞恶性生物学行为及SCAP/SREBP-1 通路的影响

冯淑炯 江巧丽

脂质代谢的重新编程是公认的恶性肿瘤标志，升高的脂质合成是癌细胞脂质代谢的最重要改变之一[1]。据报道，脂肪酸合酶表达升高可诱导癌细胞发展为S 期，刺激癌细胞增殖，在这些过程中，固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）发挥着关键的调节作用[2]。SREBPs 是一种转录因子家族，由SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP-2 组成。SREBP-1a 和SREBP-1c 这两种SREBP-1 亚型在高尔基体中加工生成成熟的SREBP-1 蛋白，主要调节所需基因的表达，用于脂肪酸合成，SREBP-2 负责胆固醇的合成[3]。研究显示，SREBP-1 在胶质母细胞瘤组织中高度存在，其活性N 端高度定位在肿瘤细胞核中[4]。SREBPs 的活性受到伴游蛋白、SREBP 裂解激活蛋白（SCAP）和胰岛素诱导基因（Insig）的精确控制。研究显示，桃叶珊瑚苷对创伤性脑损伤和抗骨质疏松有潜在药理作用[5]。此外，桃叶珊瑚苷对脑血管疾病也有一定功效[6]。本研究拟探讨桃叶珊瑚苷对人结肠癌HT-29细胞恶性生物学行为及SCAP/SREBP-1 通路的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞及药物 人结肠癌HT-29 细胞（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，批号J501307）；桃叶珊瑚苷（原料药，纯度98%，长沙上禾生物科技有限公司，批号AS-9653）；5-氟尿嘧啶（原料药，纯度99%，武汉宏信康精细化工有限公司，批号51-21-8）。

1.2主要试剂及仪器 RPMI 1640 培养基、DMEM培养基（上海微科生物技术有限公司，批号P875-N10、P607-10）；胎牛血清、青霉素、链霉素（上海素尔生物科技有限公司，批号XC45632、XC41565、XC25954）；四唑盐（MTT）试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司，批号AS-0057L）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma-Aldrich 公司，批号87463）；基质胶（Matrigel）、PBS 缓冲液（美国BD Biosciences 公司，批号ZA-231236、ZA-11095）；膜联蛋白V/碘化丙啶双重染色试剂盒（上海阳光生物科技有限公司，批号CS4156）；Trizol 试剂（北京全式金生物技术有限公司，批号AQ132-21）；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq）（日本Takara 公司，批号SX487、SX6079）；放射免疫沉淀液、二辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒、聚偏二氟乙烯膜、超敏ECL化学发光试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号EW-48-63、EW-51-27、EW-5011、EW-6613）；鼠抗人SCAP、SREBP-1、GAPDH 单克隆抗体、鼠抗人二抗（美国Cell Signaling Technology Inc 公司，批号TS-65631、JT-58596、JT-58596、JT-0017）；酶标仪（深圳市投脑智富科技有限公司，型号：RT-6000）；Transwell 腔室系统（北京佰乐良成科技有限公司，型号：CULTEX LTC）；显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：IX71）；流式细胞仪（美国BD 公司，型号：FACSCaliburTM）；实时荧光定量PCR 仪（美国伯乐公司，型号：9600）；凝胶成像仪（北京广开源商贸有限公司，型号：IAS-500）。

1.3细胞培养及分组 人结肠癌HT-29 细胞在RPMI 1640 培养基中培养，该培养基补充了10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素。细胞培养环境为：37℃、5%CO2、2%O2、93%N2，进行后续试验。分组设计：结肠癌HT-29 细胞组：细胞浓度为5×106个/mL 的人结肠癌HT-29 细胞液在10%胎牛血清的DMEM 中培养；5-氟尿嘧啶组：细胞培养方法同结肠癌HT-29 细胞组，加入浓度为30μmol/L 的5-氟尿嘧啶[7]；桃叶珊瑚苷低、高剂量组的细胞培养方法同结肠癌HT-29 细胞组，分别加入浓度为50、100μmol/L 的桃叶珊瑚苷[8]。以上各组每孔设6 个平行样，培养72h。

1.4细胞增殖测定 将细胞以每孔2×104个的密度接种到96 孔板中，每孔加入100μg MTT 试剂，孵育4h，然后加入150μL DMSO，使用酶标仪测量在490nm 处的吸光度OD 值来评估活细胞的数目。计算细胞存活率，细胞存活率（%）=（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）×100%，空白组含有培养液、MTT、DMSO。

1.5细胞凋亡水平测定 使用膜联蛋白V/碘化丙啶双重染色检测细胞凋亡。收集每组中的细胞，消化并重悬于PBS 中，根据试剂盒提供的方案，使用流式细胞仪检测细胞凋亡，在流式细胞仪图中，左下象限代表细胞碎片，而右下象限和右上象限分别代表早期和晚期凋亡细胞，左上象限对应死细胞。根据以下公式，将每组的凋亡率计算为三个独立测量值的平均值：凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.6细胞侵袭迁移水平测定 在Transwell 腔室系统中进行Matrigel 跨膜侵袭测定。将完全培养基添加到用Matrigel 预处理的Transwell 板的上腔室中，然后将含有10%胎牛血清的完全培养基添加到下腔室中，在37℃下孵育1h，以1×105个/mL 的细胞密度悬浮，并将200μL 悬浮液转移至上室，然后孵育24h。随后，收集滤膜上的细胞，结晶紫染液染色，并在显微镜下计数细胞数目。

1.7细胞SCAP、SREBP-1 mRNA 水平测定 Trizol试剂从培养的细胞中分离总RNA，使用逆转录试剂盒进行反转录，使用荧光定量PCR 试剂进行反应，SCAP、SREBP-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由上海阳光生物科技有限公司合成，序列如下：SCAP 正 向：5'-GTTCACGGACATGGAGCACGA-3'，反向：5'-GTGGCTCTTGATGATCAGGTC-3'；SREBP-1 正向：5'-GAAGGGAGTGACCATCATCG-3'，反向：5'-TTAAAGCACCCAGGCTTGAT-3'；GAPDH 正 向：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反 向：5'-GCCATCACGCCACAGTTTCCAT-3'。SCAP、SREBP-1 mRNA 的表达水平通过2-△△Ct 方法确定。PCR 总反应体系（10μL）为：SYBR Premix Ex Taq 4μL，cDNA 模板1μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，去离子水4μL。循环条件为：95℃30s，95℃10s 和60℃30s，共40 个循环系统。

1.8细胞SCAP、SREBP-1 蛋白水平测定 细胞在含有苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀液中裂解，然后以12000r/min，4℃离心15min，收集上清液，并使用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，将相同量的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，将印迹膜用5%脱脂牛奶在室温下封闭1h，再在4℃下与SCAP、SREBP-1、GAPDH 一抗（稀释比1∶1000）孵育过夜，然后在室温下与鼠抗人二抗（稀释比1∶3000）孵育1h。最后，通过超敏ECL 化学发光试剂盒检测免疫反应性，使用Image J 软件进行条带强度的检测和定量。

1.9统计学方法 应用SPSS 24.0 软件对数据进行录入、统计分析，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组结肠癌HT-29 细胞OD 值、存活率比较与结肠癌HT-29 细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组结肠癌HT-29 细胞OD 值、存活率降低（P 均＜0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，桃叶珊瑚苷低、高剂量组OD 值、存活率升高（P 均＜0.05）；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，桃叶珊瑚苷高剂量组OD 值、存活率更低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组结肠癌HT-29 细胞OD 值、存活率比较（±s）

表1 各组结肠癌HT-29 细胞OD 值、存活率比较（±s）

注：5-氟尿嘧啶组为结肠癌HT-29 细胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶；桃叶珊瑚苷低剂量组为结肠癌HT-29 细胞+50μmol/L 的桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷高剂量组为结肠癌HT-29 细胞+100μmol/L 的桃叶珊瑚苷；OD 值为吸光度；与结肠癌HT-29 细胞组比较，aP＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP＜0.05；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，cP＜0.05

2.2各组结肠癌HT-29 细胞凋亡率比较 与结肠癌HT-29 细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组凋亡率升高（P 均＜0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，桃叶珊瑚苷低、高剂量组凋亡率降低（P均＜0.05）；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，桃叶珊瑚苷高剂量组凋亡率较高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组结肠癌HT-29 细胞凋亡率比较（%，±s）

表2 各组结肠癌HT-29 细胞凋亡率比较（%，±s）

注：5-氟尿嘧啶组为结肠癌HT-29 细胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶；桃叶珊瑚苷低剂量组为结肠癌HT-29 细胞+50μmol/L 的桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷高剂量组为结肠癌HT-29 细胞+100μmol/L 的桃叶珊瑚苷；与结肠癌HT-29 细胞组比较，aP＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP＜0.05；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，cP＜0.05

2.3各组结肠癌HT-29 细胞侵袭迁移能力比较与结肠癌HT-29 细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组穿膜数降低（P 均＜0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，桃叶珊瑚苷低、高剂量组穿膜数升高（P 均＜0.05）；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，桃叶珊瑚苷高剂量组穿膜数降低（P＜0.05）。见表3、图1。

图1 各组结肠癌HT-29 细胞穿膜数数目比较（结晶紫染色×200）

表3 各组结肠癌HT-29 细胞侵袭迁移能力比较（个，±s）

表3 各组结肠癌HT-29 细胞侵袭迁移能力比较（个，±s）

注：5-氟尿嘧啶组为结肠癌HT-29 细胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶；桃叶珊瑚苷低剂量组为结肠癌HT-29 细胞+50μmol/L 的桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷高剂量组为结肠癌HT-29 细胞+100μmol/L 的桃叶珊瑚苷；与结肠癌HT-29 细胞组比较，aP＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP＜0.05；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，cP＜0.05

2.4各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 mRNA表达水平比较 与结肠癌HT-29 细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组SCAP、SREBP-1 mRNA 表达水平降低（P 均＜0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，桃叶珊瑚苷低、高剂量组SCAP、SREBP-1 mRNA 表达水平升高（P 均＜0.05）；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，桃叶珊瑚苷高剂量组SCAP、SREBP-1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 mRNA 表达水平比较（±s）

表4 各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 mRNA 表达水平比较（±s）

注：5-氟尿嘧啶组为结肠癌HT-29 细胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶；桃叶珊瑚苷低剂量组为结肠癌HT-29 细胞+50μmol/L 的桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷高剂量组为结肠癌HT-29 细胞+100μmol/L 的桃叶珊瑚苷；SCAP 为固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白；SREBP-1 为固醇调节元件结合蛋白-1；与结肠癌HT-29 细胞组比较，aP＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP＜0.05；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，cP＜0.05

2.5各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平比较 与结肠癌HT-29 细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组SCAP、SREBP-1蛋白表达水平降低（P 均＜0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，桃叶珊瑚苷低、高剂量组SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平升高（P 均＜0.05）；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，桃叶珊瑚苷高剂量组SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平比较

表5 各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平比较（±s）

表5 各组结肠癌HT-29 细胞SCAP、SREBP-1 蛋白表达水平比较（±s）

注：5-氟尿嘧啶组为结肠癌HT-29 细胞+30μmol/L 的5-氟尿嘧啶；桃叶珊瑚苷低剂量组为结肠癌HT-29 细胞+50μmol/L 的桃叶珊瑚苷；桃叶珊瑚苷高剂量组为结肠癌HT-29 细胞+100μmol/L 的桃叶珊瑚苷；SCAP 为固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白；SREBP-1 为固醇调节元件结合蛋白-1；与结肠癌HT-29 细胞组比较，aP＜0.05；与5-氟尿嘧啶组比较，bP＜0.05；与桃叶珊瑚苷低剂量组比较，cP＜0.05

3 讨论

桃叶珊瑚苷是一种重要的生物活性物质，具有清湿热、利小便、镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等作用，能促进肝细胞再生，明显抑制乙型肝炎病毒DNA复制[9]。有研究提示，桃叶珊瑚苷可能通过结合RXRa抑制肿瘤β-catenin 信号表达[10]。本研究结果发现，5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组OD 值、存活率、穿膜数低于结肠癌HT-29 细胞组，凋亡率高于结肠癌HT-29 细胞组。说明桃叶珊瑚苷能明显抑制人结肠癌HT-29 细胞增殖、侵袭，促进其凋亡。

研究发现，许多癌细胞显示出高水平的脂滴，包括结直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、乳腺癌和前列腺癌等[11]。调节葡萄糖代谢抑制脂肪形成可能会阻止肿瘤细胞增殖和侵袭。在分子水平上，许多与从头脂肪酸合成有关的基因在癌细胞中高表达，并与多种恶性表型有关[12]。脂肪酸合酶（FASN），ATP 柠檬酸裂合酶（ACL），乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）是涉及从头脂肪酸合成的关键酶。积累的证据表明，参与脂肪形成的SCAP/SREBP 途径异常通常与肿瘤的发生和发展有关[13]。SREBPs 是控制脂肪形成的关键转录因子。SCAP 通过将SREBP 从内质网转运到高尔基体来激活SREBP。Insig 与SCAP 的结合可防止高尔基体运输和激活SREBP。在高尔基体中，位点1 和2 的蛋白酶（S1P 和S2P）顺序切割SREBPs 释放其N 末端结构域，后者进入细胞核，导致参与脂质合成和摄取的基因转录。SREBPs 靶向脂肪酶的过度表达导致异常的新生脂质产生，持续的脂质消耗和不受限制的细胞生长。在本研究中，桃叶珊瑚苷处理后结肠癌细胞中SREBP-1 激活受到抑制。提示桃叶珊瑚苷可能通过SREBP-1 进而影响结肠癌细胞的脂肪生成。

SCAP 是激活SREBPs 所需的完整膜蛋白。在缺乏SCAP 的细胞中，SREBPs 无法转运至高尔基体，并在细胞质中失活。据报道，SCAP 在前列腺癌细胞中过表达并促进线粒体呼吸，脂肪抑制素对SCAP的抑制可削弱SREBP 活性，并显著减弱人胶质母细胞瘤的生长[14]。为探讨桃叶珊瑚苷是否通过SCAP 调节SREBP-1 的活化，本研究进行相关实验发现5-氟尿嘧啶组、桃叶珊瑚苷低、高剂量组SCAP、SREBP-1 mRNA 和蛋白表达水平低于结肠癌HT-29 细胞组。这说明SCAP、SREBP-1 相互作用的一致性。桃叶珊瑚苷处理后结肠癌细胞中SCAP 与SREBP-1 相互表达减弱。

综上所述，桃叶珊瑚苷能明显抑制人结肠癌HT-29 细胞增殖、侵袭，促进其凋亡；其机制可能与桃叶珊瑚苷抑制SCAP/SREBP-1 通路的激活有关。