miR-101靶向mTOR信号通路调控足细胞自噬在小鼠糖尿病肾病发病中的作用研究

胡玲，周乐汀，王思思，王凉，孙铸兴

(南京医科大学附属无锡人民医院 肾内科，江苏 无锡 214023)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)的常见并发症，临床表现为蛋白尿、肾功能不全，最后发展为终末期肾脏疾病[1]。足细胞是肾小球滤过屏障的关键结构，在防止血浆蛋白渗漏方面发挥着重要作用。研究表明，足细胞数量的减少以及结构和功能的改变会严重破坏肾小球滤过屏障的完整性，促进肾小球硬化，加速DN的进展[2]。自噬作为真核细胞的固有生理功能，是细胞降解的重要方式，对于维持细胞内环境和细胞存活至关重要。越来越多的研究表明，自噬是DN足细胞赖以生存、维持自身稳态的重要保护机制[3]。在正常条件下，足细胞表现出高水平的自噬活性，但DN足细胞的自噬水平降低，导致肾脏病理损伤进行性加重[4]。在自噬众多的调控因素中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路占有枢纽地位。mTOR激活通过调节微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)、核糖体S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase1,S6K1)和其他蛋白质的表达，抑制自噬体的形成，从而导致足细胞损伤[5]。微小RNA(microRNA，miR)是一类非编码单链小RNA分子。大量研究证实miR在肾脏纤维化和DN发病机制中均发挥重要作用。通过检索生物学信息预测网站，发现miR-101、miR-200b、miR-200c在DM中与mTOR有潜在结合位点。其中miR-101被报道在多种肿瘤细胞自噬过程中起着调控作用[6]。然而，miR-101能否通过调控mTOR信号通路诱导足细胞自噬，目前国内外尚无相关报道。因此，本研究旨在探讨miR-101靶向mTOR信号通路在DN足细胞自噬中的作用，为DN的防治提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂与仪器

雷帕霉素、链脲佐菌素和戊二醛(美国Sigma公司)；C57BL/6小鼠(南京大学动物模式研究所)；过碘酸-雪夫氏(Periodate-Shev’s，PAS)染液、苏木精染液和柠檬酸铅染液 (上海碧云天生物技术研究所)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒和Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列：miR-101上游引物5′-GTACAGTACTGTGATA ACTGA-3′，下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；Nephrin上游引物5′-GCCTCCCTTCTTCTAAGCAGTCTA-3′，下游引物5′-TCAGTTCTCTCCACTTTGATGCC-3′；LC3Ⅰ上游引物5′-TCCGACCGGCCTTTCAAGCAG-3′，下游引物5′-GAGAACCTGACCAGAACTCCCAG-3′；LC3Ⅱ上游引物5′-AAACGCATTTGCCATCACAGT-3′，下游引物5′-GTGAGGACTTTGGGTGTGGTTC-3′；mTOR上游引物5′-ATTTGATCAGGTGTGCCAGT-3′，下游引物5′-GCTTAGGACATGGTTCATGG-3′；AMPK上游引物5′-GCTGTGGATCGCCAAATTAT-3′，下游引物5′-CACGTGCTCATCATCGAAAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′；ASP300S型组织脱水机、EG1150型包埋机、Leica RM2255型全自动轮转切片机等病理配套设备(德国Leica公司)；奥林巴斯CX43显微镜(日本奥林巴斯公司)；TECNAI-10 透射电子显微镜(荷兰Philips公司)；NanoDrop 2000c型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)；CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国BD公司)。

1.2 分组及造模

选30只成年雄性C57BL/6小鼠适应性喂养1周后进行实验。将小鼠平均分为对照组、模型组和雷帕霉素组，每组10只。在禁食不禁水12 h 后，模型组和雷帕霉素组小鼠连续腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(55 mg·kg-1)5 d，对照组腹腔注射等量生理盐水。腹腔注射STZ后1 周，采用尾静脉针刺取血的方法检测小鼠空腹血糖，血糖>13.8 mmol·L-1即确定DM 模型构建成功。造模成功后，雷帕霉素组小鼠腹腔注射雷帕霉素(2 mg·kg-1)，对照组和模型组小鼠腹腔注射等量生理盐水，隔天1次，连续12周后进行相关检测。

1.3 肾脏组织PAS染色

脊髓脱臼处死小鼠，切取双侧肾脏，剥离肾脏包膜及肾周脂肪。左侧肾脏经福尔马林固定，石蜡包埋，切片(3 μm)，二甲苯脱蜡(20 min)，蒸馏水冲洗。1.5%高碘酸处理25 min，蒸馏水反复洗涤，PAS染色30 min。流水冲洗10 min，直至显出红色。苏木素复染5 min，流水冲洗。脱水，透明，封片。在光镜下观察染色结果并照相。PAS染色结果判定：肾小球基膜、系膜基质、纤维蛋白等呈紫红色即为PAS阳性，细胞核呈浅蓝色。光镜观察肾小球病理变化。

1.4 透射电镜观察足细胞损伤及自噬情况

快速剪取少量右肾皮质置于预冷的2.5%戊二醛中，剩余部分置于液氮中保存。用刀片在固定液中将组织切成约1 mm3大小。在冰上用锋利的刀片快速准确切取肾皮质，磷酸盐缓冲液漂洗3次，1%锇酸固定样品1 h，再用磷酸盐缓冲液漂洗3次。用不同浓度的丙酮逐级脱水，最后无水丙酮渗透后环氧树脂包埋，切片(60 nm)，用柠檬酸铅染色10 min，用蒸馏水漂洗3次，然后醋酸铀染色30 min，再用蒸馏水漂洗3次，待切片干燥后在透射电镜下观察。

1.5 实时荧光PCR(RT-PCR)检测肾组织中miR-101、Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、mTOR和AMPK mRNA的表达

将右肾研碎，采用Trizol法提取总RNA，并进行RNA浓度和纯度的测定，将提取的总RNA根据反转录试剂盒说明合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ荧光定量PCR试剂盒说明，制备20 μl反应体系，在CFX-96 PCR扩增仪中进行扩增。反应条件为预变性95 ℃ 30 s，变性 95 ℃ 5 s、60 ℃ 44 s，40个循环，61 ℃采集荧光，用实时荧光定量 PCR仪检测表达量。以GAPDH作为内参，采用 2-△△Ct法计算miR-101、Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、mTOR和AMPK mRNA的相对表达量。

1.6 统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验结果采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肾脏组织形态学

对照组小鼠肾脏基本正常，模型组小鼠肾脏局部可见球囊融合，系膜基质明显增多，雷帕霉素组小鼠肾脏系膜基质明显减少，见图1。与对照组相比，模型组和雷帕霉素组小鼠系膜基质面积明显增多[(22.18±4.25)、(16.02±3.10) μm2vs(7.92±1.13) μm2，t=10.254、7.763，P<0.001]；与模型组比较，雷帕霉素组小鼠系膜基质面积明显减少[(16.02±3.10) μm2vs(22.18±4.25) μm2，t=3.703，P=0.002]。

图1 各组小鼠肾脏组织PAS染色结果 ×400

2.2 各组小鼠肾脏足细胞自噬情况

对照组小鼠肾脏足细胞足突正常；而模型组小鼠肾脏基底膜明显增厚，足突明显增宽、融合，自噬体明显减少；雷帕霉素组小鼠肾脏基底膜增厚和足突融合明显减轻，自噬体明显增加。见图2、3。

图2 各组小鼠肾脏足细胞足突、基底膜情况 ×1 000

2.3 各组小鼠肾组织中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101、mTOR和AMPK mRNA水平比较

与对照组相比，模型组和雷帕霉素组小鼠肾组织中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101和AMPK mRNA水平明显降低，mTOR mRNA水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，雷帕霉素组小鼠肾组织中Nephrin、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、miR-101和AMPK mRNA水平明显升高，mTOR mRNA水平明显降低(P<0.05)。见表1。

3 讨 论

DM会导致肾脏足细胞不可逆的损伤和功能障碍，从而导致足细胞数量减少，加速DN的进展。本研究发现，模型组小鼠肾脏组织中的足细胞在形态、结构和数量方面与对照组小鼠存在显著差异。Nephrin是足细胞特异性标记分子，具有离子通道和信号转导功能，在足细胞形态、组织结构和足隔膜功能调节中发挥重要作用[7]。DM患者发生足细胞损伤，Nephrin的表达水平发生改变[8]。RT-PCR分析显示，模型组小鼠Nephrin mRNA表达水平明显低于对照组，证实DM引起肾细胞损伤，PAS染色结果也支持这一结论。

自噬是一种细胞的自我保护机制，发生在老化或受损的细胞，以清除受损的细胞器和大分子。DN个体自噬水平下降，导致细胞器和大分子在细胞内积累，无法被清除，从而导致足细胞损伤[9]。雷帕霉素是 mTOR信号通路特异性的抑制剂，其对足细胞的保护作用可能与抑制mTOR有关。在DN的研究中发现，雷帕霉素与mTOR激酶结合，抑制mTOR活性，调节自噬，减轻肾脏损伤和功能失调[10]。本研究结果显示，与对照组相比，模型组自噬降低，雷帕霉素组自噬升高。自噬受多种信号通路的调控，mTOR在自噬信号通路中占有举足轻重的地位[11]。mTOR的激活可以抑制自噬小体的形成，其上游调节因子包括生长因子、胰岛素水平、营养、代谢条件和机械变化。这些因素的变化在DM患者中广泛存在，并已在许多研究中得到证实[12]。激活的mTOR通过磷酸化S6K1调控DM个体足细胞的Nephrin mRNA翻译和转录等重要生理功能，从而减少自噬[13]。LC3Ⅰ和LC3-Ⅱ是哺乳动物自噬体膜蛋白的标志物，可以反映自噬的变化[14]。本研究发现，模型组小鼠肾组织中mTOR水平明显增多，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平降低，而给予雷帕霉素干预后结果相反，证实了mTOR信号通路在DN肾损伤中的重要作用。DN的发生可能与自噬诱导足细胞的损伤和破坏有关，这种自噬的改变与足细胞中mTOR的活性有关。因此，通过抑制足细胞mTOR激活来维持自噬可能是DN的重要治疗靶点。

为了寻找mTOR表达下调的可能机制，作者通过DIANA-MICROT和MICRORNA.ORG等生物信息学软件发现，miR-101与mTOR mRNA的3′-UTR之间存在靶向结合位点。值得注意的是，miR-101过表达可以显著促进直肠癌细胞自噬[15]。此外，在雷帕霉素干预的情况下，DN小鼠肾组织中miR-101过表达，抑制mTOR信号通路的激活，提示miR-101可能参与了DN的发病和进展。为了进一步研究miR-101参与DN发病机制的分子机制，我们研究了miR-101对AMPK/mTOR信号通路的影响。mTOR已被确定为AMPK的一个间接靶点，并受到AMPK的负调控，这一过程对细胞的生长和存活至关重要。据报道，MAPK诱导的mTOR抑制发生在神经毒素三丁基锡诱导的神经元死亡过程中的自噬[16]。过氧化氢通过激活AMPK抑制mTOR信号通路并导致神经元凋亡[17]。在本研究中，miR-101过表达下调了mTOR mRNA表达，同时增强了AMPK mRNA表达。这些结果提示miR-101过表达可能通过抑制mTOR信号通路阻止DN的进展。

综上所述，自噬在DN发病机制中起着至关重要的作用，miR-101通过靶向抑制mTOR水平促进DN小鼠足细胞自噬，同时促进MAPK的表达，诱导足细胞凋亡，可能是DN患者治疗的新靶点。