肽基精氨酸脱亚胺酶4在类风湿关节炎中的表达及意义

庞春艳，常志芳，王馨，白力，王永福,

(1.包头医学院第一附属医院 风湿免疫科,内蒙古 包头 014010;2.内蒙古自治区自体免疫学重点实验室,内蒙古 包头 014010)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性炎症为主的自身免疫性疾病，肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)能将体内蛋白质中的精氨酸残基转变为瓜氨酸残基，而瓜氨酸化在RA的发病中起着重要作用，瓜氨酸化可打破机体的免疫耐受、激活自身免疫反应。因此，PAD4是亚洲人群RA的易感基因，在RA患者的滑膜中表达增高，它能促使RA发病以及加速病程进展[1]。本研究主要分析RA患者PAD4蛋白和mRNA的表达水平以及RA患者PAD4蛋白的表达水平与类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸肽(cyclic citrunilated peptides，CCP)抗体和28个关节的疾病活动度评分(the disease activity score using 28 joint counts，DAS28)的相关性，探讨PAD4对RA的诊断和治疗价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

ELISA试剂盒购自美国BIOMATIK公司和德国的欧蒙公司，逆转录试剂盒(RvertAid First Strand cDNA Synthesis)和PowerUpTM®SYBR Green Master Mix购自美国Thermol Fisher公司。

1.2 血清中PAD4、RF-IgM和抗CCP抗体的检测

收集90例RA患者和76例健康对照者的血清，-20 ℃保存备用。RA患者的年龄为(56.68±12.45)岁，其中男性占24%；健康对照者的年龄为(54.38±9.91)岁，其中男性占16%。两组在年龄和性别方面差异无统计学意义(P>0.05)。特种蛋白仪检测RA患者血清中RF-IgM的表达水平。ELISA法检测血清中PAD4、RF-IgA、RF-IgG和抗CCP抗体的表达水平。PAD4的检测按BIOMATIK公司的ELISA试剂盒说明书进行操作，方法如下：加100 μl标准品或血清，37 ℃孵育1 h；吸出液体，加100 μl检测试剂A，37 ℃孵育1 h；吸出液体，洗涤3次；加100 μl检测试剂B，37 ℃孵育30 min；吸出液体，洗涤5次；加90 μl底物，37 ℃孵育15 min；加50 μl终止液，450 nm读取吸光度值；根据标准曲线计算样本浓度。RF-IgA、RF-IgG和抗CCP抗体按欧蒙公司的ELISA试剂盒说明书进行操作，方法如下：加100 μl标准品或100倍稀释后的血清，室温孵育1 h；吸出液体，洗涤3次；加100 μl酶结合物，室温孵育30 min；吸出液体，洗涤3次；加100 μl底物，室温孵育30 min；加100 μl终止液，450 nm读取吸光度值；根据标准曲线计算样本浓度。

1.3 PAD4抑制剂F-amidine干预后外周血单个核细胞(PBMC)增殖情况检测

收集RA患者的EDTA抗凝全血，淋巴细胞分离液分离PBMC，RPMI 1640培养基加10%的胎牛血清进行培养。PBMC以5×104个·ml-1的浓度种植于96孔板，实验分为空白组、阴性对照组、7.5 μmol·L-1F-amidine治疗组、15 μmol·L-1F-amidine治疗组、30 μmol·L-1F-amidine治疗组和60 μmol·L-1F-amidine治疗组，空白组不做任何处理，阴性对照组加同等体积的二甲基亚砜，分别作用24、48和72 h。CCK-8检测细胞增殖情况。

1.4 F-amidine干预后PBMC凋亡情况检测

收集RA患者的EDTA抗凝全血，淋巴细胞分离液分离PBMC，以5×105个·ml-1浓度种植于6孔板。根据上述细胞增殖实验确定最佳作用浓度和最佳作用时间。实验分为空白组、阴性对照组和F-amidine治疗组。空白组细胞不做任何处理，F-amidine治疗组加入最佳浓度的F-amidine，阴性对照组细胞加入等体积的二甲基亚砜，在最佳作用时间下，流式细胞术检测PBMC凋亡的情况。

1.5 RT-PCR检测PBMC中PAD4 mRNA的表达水平

收集39例RA患者和22例健康对照者的EDTA抗凝全血，采用淋巴细胞分离液分离PBMC，Trizol法提取PBMC中总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，实时荧光定量PCR检测PAD4 mRNA的表达水平。PAD4的上游引物5′-ATGAAAGCCAAGTGCAAG-3′，下游引物5′-CGTTTTGTGTGGGGCTTG-3′，扩增长度为108 bp。内参GAPDH的上游引物5′-CTCCAGAACATCATCCCTGCCTC-3′，下游引物5′-ACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，扩增长度190 bp。PCR体系:cDNA 1 μl,PCR反应混合液 10 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl，总体积20 μl。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 RA患者和健康对照者血清中PAD4的表达水平

RA患者血清中PAD4的浓度为(5.94±0.37) ng·ml-1，健康对照者血清中PAD4的浓度为(2.30±0.18)ng·ml-1，RA患者的PAD4浓度显著高于健康对照者，差异有统计学意义(t=8.402，P<0.000 1)。PAD4蛋白诊断RA的曲线下面积为0.875，以5.07 ng·ml-1为cut-off值，其特异度为98.7%，敏感度为66.7%，见图1。

图1 PAD4诊断RA的ROC曲线

2.2 RA患者PAD4的浓度与RF-IgM、抗CCP抗体及DAS28评分的相关性

Pearson相关分析发现，PAD4与RF-IgM呈正相关(r=0.22，P=0.039)，见图2。抗CCP抗体阳性组患者PAD4的表达水平与抗CCP抗体呈正相关(r=0.258，P=0.033，图3)，但抗CCP抗体阴性组患者19例中14例有高水平的PAD4表达。PAD4蛋白的水平与RF-IgA、RF-IgG及DAS28无相关性。

图2 PAD4与RF-IgM的相关性

图3 PAD4与抗CCP抗体的相关性

2.3 F-amidine对RA患者PBMC增殖的影响

15 μmol·L-1F-amidine作用PBMC 48 h时，细胞抑制率为50%左右，见图4。接下来又检测了15 μmol·L-1F-amidine对8例RA患者PBMC作用48 h时细胞增殖情况，验证了F-amidine的最佳作用浓度是15 μmol·L-1，大部分患者细胞的抑制率在50%左右，见图5。

图4 不同浓度F-amidine对PBMC增殖情况的影响

图5 15 μmol·L-1 F-amidine作用48 h PBMC增殖情况

2.4 F-amidine对RA患者PBMC凋亡的影响

在RA患者的PBMC中加入15 μmol·L-1的F-amidine，作用48 h后收集细胞，结果发现F-amidine可以增加PBMC晚期凋亡细胞比例，差异有统计学意义，但对早期凋亡细胞的作用不明显，差异无统计学意义。见表1和图6。

表1 F-amidine对RA患者PBMC凋亡的影响 %

图6 F-amidine对RA患者PBMC凋亡的影响

2.5 RA患者和健康对照者全血中PAD4 mRNA的表达水平及其与实验室指标、DAS28评分的相关性

RA患者全血中PAD4 mRNA的表达量为7.23±9.57，明显高于健康对照者的1.00±0.00，差异有统计学意义(t=4.069，P<0.001)。Pearson相关分析显示，PAD4 mRNA与抗CCP抗体呈正相关(r=0.390，P=0.023，图7)，与RF及DAS28无相关性。

图7 PAD4 mRNA与抗CCP抗体的相关性

3 讨 论

RA是一种常见的自身免疫性疾病，主要以慢性滑膜炎症为病理改变。RA患者血清中会出现RF和抗CCP抗体。李雪飞等[2]研究显示,联合RF和抗CCP抗体检测可以提高RA患者的诊断准确性，但其中仍有1/3的RA患者血清反应是阴性的[3]。有学者采用噬菌体展示文库技术筛选出新兴的自身抗体，可作为抗CCP抗体和RF血清学阴性的RA患者的血清学候选指标。PAD4就是其中一种新型的血清学指标[4]。

Umeda等[5]研究发现,RA患者PAD4的表达水平明显高于系统性红斑狼疮患者和健康对照者，而且29.7%的RA患者血清中可检测到抗PAD4 抗体，且抗PAD4 抗体与抗CCP抗体密切相关。本研究也发现,RA患者中PAD4蛋白的表达水平较健康对照者明显升高，而且RA患者血清中PAD4蛋白的表达水平与RF呈正相关。关于PAD4或PAD4抗体与抗CCP抗体及DAS28的相关性研究，国内外的研究结果不尽相同[6-7]。本研究发现，在抗CCP抗阳性组中PAD4蛋白的表达水平与抗CCP抗体呈正相关，在抗CCP抗体阴性组中也有73.7%RA患者血清中PAD4的表达水平高于cut-off值。刘秀明等[8]研究发现，25%的抗CCP抗体阴性患者的抗PAD4抗体为阳性，提示抗CCP抗体阴性的RA患者中可以检测到PAD4及其抗体的表达，具体的机制还有待深入研究。本研究发现PAD4 与DAS28无相关性，可能与RA患者的疾病活动度大多为低中疾病活动度有关。RA患者中可以检测到更高水平的PAD4的表达，提示它可以用作RA患者的辅助诊断。

Verheul等[9]对日本、荷兰和意大利等国家的12项研究进行Meta分析，结果发现抗CCP抗体和RF单独或者联合诊断RA的敏感度为59%～88%，特异度为65%～100%。国内的研究发现,血清RF诊断RA的ROC曲线下面积为0.742，血清抗CCP抗体诊断RA的ROC曲线下面积为0.813[10]。唐笛娇等[11]研究发现,抗CCP抗体诊断RA的敏感度为66.92%，特异度为76.09%，RF-IgM诊断RA的敏感度为66.15%，特异度为82.95。Vos等[12]采用第2代和第3代的抗CCP抗体诊断RA，结果发现第2代的抗CCP抗体诊断RA的曲线下面积为0.792，以10.5 U·ml-1为cut-off值，敏感度为80.0%，特异度为75.0%；第3代的抗CCP抗体诊断RA的AUC为0.773，以5.6 U·ml-1为cut-off值，敏感度为86.9%，特异度为61.0%。可见第2代和第3代的抗CCP抗体诊断RA的敏感度提高了，特异度变化不大。本研究发现，PAD4诊断RA的AUC为0.875，以5.07 ng·ml-1为cut-off值，敏感度为66.7%，其特异度为98.7%。提示PAD4诊断RA的价值可以与RF和第1代的抗CCP抗体相媲美，但与第2代和第3代抗CCP抗体相比，特异度提高了，敏感度没有明显变化。

郭靖等[13]研究发现,RA患者PBMC中PAD4 mRNA表达水平高于健康对照者。本研究也发现RA患者PBMC中PAD4 mRNA表达水平高于健康对照者，提示PAD4确实参与了RA的发生和发展[13]。相关性分析发现,PAD4 mRNA与抗CCP抗体呈正相关，这个结果与PAD4蛋白与抗CCP抗体的相关性结果不完全一致，可能与抗CCP抗体阴性的病例数不完全一致有关，在PAD4蛋白检测中有21.3%的患者呈抗CCP抗体阴性，而在PAD4 mRNA检测时只有11.7%呈阴性。进一步的相关性分析发现，PAD4 mRNA与RF及DAS28无相关性，可能与高疾病活动度的病例数少有关，也可能是检测PAD4 mRNA的病例数少引起的。

F-amidine是PAD4常见的抑制剂。本研究结果显示，15 μmol·L-1的F-amidine可以增加RA患者PBMC晚期凋亡细胞比例，但对早期凋亡细胞的作用不明显，提示F-amidine可能对RA有一定的治疗作用。接下来本课题组将从动物水平检测F-amidine对RA动物模型胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis，CIA)的治疗作用。