不同种类饮料对恒牙牙釉质脱矿的体外研究

赵 伟，陈雅琪，魏 霞，骆 凯,3，罗 岚,3

近年来，随着物质生活水平的提高，人们对于饮料的需求量日益增多。研究显示，市售的多种饮料均可造成牙釉质不同程度脱矿，从而导致牙酸蚀症和龋坏[1-2]。本研究选用4种常见的市售普通饮料处理恒牙牙釉质，并测定牙釉质的钙、磷溶出情况以及牙釉质表面显微硬度(surface microhardness，SMH)，比较4种饮料对恒牙牙釉质的酸蚀及脱矿作用的影响。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂 慢速锯(IsoMet Low Speed Saw，美国Buehler公司)；台式pH酸度计(pH211型，意大利HANNA公司)；iMarkTM酶标仪(680型，美国Bio-Rad公司)；紫外可见分光光度计(UV-5200，上海元析仪器有限公司)；甲基丙烯酸树脂(II型，上海新世纪齿科材料有限公司)；数字显微硬度计(HXD-1000TM/LCD，上海光学仪器厂)。实验饮料(饮料A：碳酸饮料；饮料B：果醋类饮料；饮料C：茶饮料；饮料D：运动饮料)。人工唾液配方参照ISO/TR10271：1993标准，主要成分如下：0.400 g的NaCl，0.400 g的KCl，0.795 g的CaCl2·2H2O，0.780 g的NaH2PO4·2H2O，0.005 g的 Na2S·2H2O，1.000 g尿素以及1 000 mL去离子水。

1.2方法

1.2.1恒牙的收集和保存 选取笔者医院门诊收治的因正畸治疗需要而拔除的恒牙25颗。患者年龄18～25岁，无长期碳酸饮料暴露史、釉质发育良好、无脱钙、无磨耗。牙齿排除标准：龋坏、根裂、牙合面有充填修复体、做过根管治疗；肉眼观牙冠颜色及形态与正常有差异，或有其他缺陷。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者均签署知情同意书。

25颗恒牙拔除前均去除色素和菌斑，拔除后去净牙髓组织，截除牙根后使用慢速锯将牙冠纵向劈开，共计50个样本，置于新鲜配置的人工唾液中，于4 ℃冰箱保存，拔牙后2周内用于实验。

1.2.24种饮料的pH值及钙、磷、糖浓度检测 4种饮料各取1 mL，使用pH计检测pH值；采用Bio-Rad IMARK酶标仪，应用邻甲酚肽络合铜法检测饮料的钙浓度、磷钼酸法检测饮料的磷浓度、葡萄糖氧化镁法检测饮料的糖含量，茶多酚含量见饮料成分表。

1.2.34种饮料浸泡后恒牙钙、磷离子释放程度检测 将50个样本浸泡于人工唾液中，于37 ℃恒温水浴箱中预处理24 h，之后分5组(n=10)，分别浸泡于4种饮料及人工唾液中(对照组)。采用间断性浸泡，每次浸泡1 min，取出30 s，再次浸泡，完成5次浸泡后取出，蒸馏水清洗5遍，放回37 ℃人工唾液水浴恒温箱浸泡24 h，第2天重复以上操作，每天每组试件重复上述饮料浸泡5次，每天浸泡均更换新鲜的饮料，连续处理7 d。每次浸泡所用的饮料均收集于无菌试管中，混匀后用于测定饮料及人工唾液中钙、磷含量的变化，连续测量7 d。

1.2.44种饮料浸泡后牙釉质SMH的测量 分别在实验前及实验的第1～7天采用数字显微硬度计检测5组样本的SMH。使用500 g负荷维氏钢锥连续打击釉质开窗区表面20 s，使其形成压痕，测量压痕的两对角线长度，输入计算机自动计算出SMH。所有样本均在开窗部位的不同点反复测量多次。每个样本的开窗区均测量5个点，取测量压痕规则的3个点的平均值作为该样本该次的SMH值(单位为HV)。

1.3统计学处理 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。对不同种类饮料处理后的牙釉质SMH以及钙、磷溶出值采用重复测量方差分析的统计方法，两两比较采用Bonferroni法校正显著水平，检验水准为α=0.05，P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.14种饮料的pH值及钙、磷、糖浓度 4种饮料及人工唾液的pH值分别为2.93，3.75，6.48,3.79和6.73，所含的钙、磷、糖检测结果见表1，其中茶饮料的茶多酚含量为998 mg/L，余未测出茶多酚。

表1 4种饮料的pH值和钙、磷、糖浓度等的检测结果

2.24种饮料浸泡后牙釉质钙、磷溶出量 4种饮料浸泡后，恒牙牙釉质钙、磷的溶出量见表2和图1。4种饮料均能导致恒牙牙釉质出现不同程度的脱矿，其中果醋类饮料和运动饮料对牙釉质中钙、磷的溶出作用最明显，而茶饮料的溶出作用最不明显。在不同饮料中持续试验7 d后，浸泡液中钙、磷浓度的变化差别均具有统计学意义(P<0.05)。饮料种类和作用天数两种因素共同作用导致的钙、磷浓度变化的差别也具有统计学意义(P<0.05)。4种饮料导致钙、磷的溶出量与人工唾液对照组比较，变化均有统计学意义(P<0.05)，且同种饮料各时间点的钙、磷浓度变化差别也有统计学意义(P<0.05)。

表2 4种饮料导致恒牙牙釉质钙、磷溶出量的变化

2.3不同类型饮料浸泡后牙釉质SMH变化 经碳酸饮料、果醋类饮料以及运动饮料连续浸泡7 d后，恒牙牙釉质的SMH均显著下降，而茶饮料组的SMH值起初呈平稳下降趋势，之后逐步回升。不同饮料按照试验设计浸泡7 d，各组牙釉质SMH值间的差别均具有统计学意义(P<0.05)，饮料种类和实验天数两种因素共同作用对恒牙牙釉质SMH的降低也均具有统计学意义(P<0.05，表3，图1C)。4种饮料处理过的牙釉质SMH均较人工唾液对照组均有所下降，其中碳酸饮料组、果醋类饮料组、运动饮料组与对照组的差别有统计学意义(P<0.05)，且浸泡的1～7 d与实验前比较，差别均有统计学意义(P<0.05)。

表3 4种饮料导致恒牙牙釉质表面显微硬度的变化

n=10。1组：人工唾液；2组：碳酸饮料；3组：果醋类饮料；4组：茶饮料；5组：运动饮料。A：钙溶出量；B：磷溶出量；C：牙釉质表面显微硬度。

3 讨 论

在过去的几十年里，软饮料的消费量急剧增加，其中儿童和青少年对软饮料的消费增幅最大。过量饮用含高糖和高酸的软饮料，都会对牙齿和身体造成不利影响，包括龋齿、超重、肥胖和增加患2型糖尿病的风险[3]。目前一些市售的饮料为了加强口感，常添加一些高酸度的成分，可导致釉质的脱矿。Milosevic等[4]认为，牙齿的酸蚀与饮用饮料有关，频繁饮用或睡前饮用果汁、碳酸饮料均会增加牙齿酸蚀的严重程度。为了评估不同种类饮料对恒牙牙釉质脱矿的影响，本实验选用因正畸治疗需要而拔除的新鲜恒牙，以常见的市售饮料进行浸泡，检测浸泡前后饮料中钙、磷含量以及牙釉质SMH的变化。当前，国内外均有学者开展饮料对牙釉质脱矿作用相关影响的研究[5-6]。然而，这些研究多将牙齿或牙片长时间浸泡于同一饮料中，与日常生活情况不符。Maupomé-Carvantes等[7]研究表明，定量研究饮料的实际作用时，实验条件应尽量接近现实生活，得出的结果才真实可信。Xavier等[8]的研究发现，酸性碳酸饮料对牙釉质表面的酸蚀作用在接触5 min内即可发生。故本研究采用间断性浸泡的方式，每次浸泡均使用新鲜溶液持续1 min，间歇30 s，共进行5次。实验间隙期各组样本均浸泡于人工唾液中，使实验条件尽量接近日常饮用饮料的实际状态。

牙釉质是人体内组织中最硬且钙化程度最高的组织。牙釉质的硬度由其所含无机物的晶体决定，釉质中不稳定型的磷酸钙盐，在酸性环境下发生化学反应导致钙、磷离子释出[9]。Featherstone等[10]利用定量显微放射照相技术测定牙釉质矿物质的含量，发现其与显微硬度仪测得的硬度值具有显著的相关关系。本实验结果表明：4种不同种类的饮料均可对牙釉质造成不同程度的脱矿作用，导致釉质中钙和磷溶出并降低SMH，且不同饮料间的作用差别具有统计学意义。其中果醋类饮料组的钙、磷溶出作用最明显，而茶饮料组的溶出作用不明显。对4种饮料的pH值检测结果显示，果醋类饮料、碳酸饮料、运动饮料的pH值均较低，属于酸性饮料，低于牙釉质脱矿的临界值(5.0～5.5)[11]，因此上述饮料均可使恒牙牙釉质中不稳定的磷酸钙盐发生化学反应而溶出。实验结果也证实了果醋类饮料、碳酸饮料和运动饮料中的钙、磷溶出量较高。结果也显示碳酸饮料浸泡组牙釉质的钙、磷溶出量并不是最多，究其原因可能是由于可乐等碳酸饮料钙、磷含量较高，因此浸泡液中的钙、磷较快达到饱和状态，使其溶出量并不是最多。唾液中高浓度钙、磷离子过饱和时容易形成结晶，结晶沉积在牙釉质脱矿面上，促进了釉质再矿化。Attin等[12]的研究发现，在碳酸饮料中添加钙、磷酸盐和氟化物可降低碳酸饮料的腐蚀潜力，钙和磷酸盐的添加显示出有益的效果，但并不能完全防止釉质溶解。而向碳酸饮料中添加甘油磷酸钙能显著防止釉质SMH的降低和矿物质的损失[13]。

Maupomé等[14]的研究发现，脱矿1周后牙表面的压痕即不容易看清，不能准确反映牙釉质矿物质的含量和脱矿程度，因此本研究选择将恒牙牙釉质块浸泡于饮料7 d内进行试验分析，结果显示，从浸泡前到实验后第7天，碳酸饮料、果醋类饮料以及运动饮料导致的恒牙牙釉质SMH均值均明显降低。Li等[15]通过原子力显微镜，在纳米水平上定量评估了可口可乐等市售饮料在不同时间点所引起的人类牙釉质表面粗糙度(RQ)和弹性模量(E)的变化，结果显示，在接触可乐等碳酸饮料的过程中，牙齿的表面逐渐变得粗糙，而且随着浸泡时间的延长，牙釉质的弹性模量E值下降幅度变大，本研究结果与之一致。而茶饮料浸泡组则在实验前期呈平稳下降趋势，之后呈现回升的趋势。究其原因可能因为本实验测得的茶饮料的pH为6.48，Gul等[16]发现红茶浸泡处理的牙菌斑酸碱度均高于牙脱矿临界值(pH=5.5)，对牙齿的脱矿作用影响较小。茶饮料与其他饮料相比较，富含茶多酚、氟化物和铁，茶多酚能抑制致龋菌的生长，氟离子能进入羟磷灰石晶体中，形成氟化钙，增加釉质抵抗饮料的酸蚀，降低釉质溶解度减少脱矿。Soares等[17]发现，在未经氟化物保护的牙釉质中，牙釉质表面经过各种软饮料浸泡腐蚀后可检测到不同程度的凹陷、疏松、表面不规则和结构破坏，而经过氟处理保护的牙釉质，避免了软饮料酸蚀后釉质表面粗糙度的增加。

综上所述，果醋类饮料、运动饮料以及碳酸饮料均可导致牙釉质出现不同程度的脱矿，其中果醋类饮料的脱矿作用最强，其次是运动饮料及碳酸饮料，而茶饮料对牙釉质的脱矿作用相对较轻。建议儿童及青少年应尽量减少酸性饮料的摄入频率。人体口腔是个复杂的环境，牙釉质的酸蚀受到多方面影响：菌斑生物膜，唾液的流动，机械冲洗速度，饮料在口腔内接触的频率和方式，不同温度饮料酸蚀作用等，因此影响口腔内牙齿酸蚀化学反应的因素有许多，今后还需进一步进行相应的研究。