高效液相色谱-二极管阵列法同时测定卷烟爆珠壁材中10种水溶性合成着色剂

李响丽,张凤梅,范多青,蔡昊城,高 莉，王庆华,胡 燕,李 超

(云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231)

0 引 言

当今卷烟产品研发过程中，通过辅料维度赋香增加越发成为增香增味新趋势。卷烟滤棒中的“爆珠添加”就是一种新型加香技术，通过在过滤嘴的生产过程中植入香味爆珠，实现在卷烟吸食过程中可控的特色香味被主流烟气带出释放，并且能减少外界环境对吸味的影响和造成香精损失，丰富卷烟吸食口味，实现吸食过程的保润增湿[1]。爆珠产品由壁材、芯材两部分构成。芯材主要是包裹的香精，壁材主要是天然胶。为使产品具有风格特征，爆珠壁材使用合成色素生产成彩色样式。

合成色素大多以从煤焦油中分离出来的苯、甲苯、萘为原料，经一系列有机反应化合而成[2]，具有一定致畸致癌危害[3]。目前依据GB 2760—2011的许可要求，爆珠壁材中使用的水溶性合成着色剂主要包括诱惑红、苋菜红、赤藓红、胭脂红、酸性红、亮蓝、日落黄、柠檬黄等，而部分样品中合成着色剂的用量依据GB 2760—2011使用食品添加剂的限量要求[4]，有可能存在超量风险，但目前对爆珠壁材中合成着色剂用量尚缺乏明确的标准和控制方法。

目前合成着色剂的测定方法主要有薄层色谱法[5]、极谱法[6]、分光光度法[7]、毛细管电泳法[8]、HPLC法[9]、液相色谱-质谱法[10]等，基于对合成着色剂最小检出量精确（达到纳克水平）及简单快速检测的需求，当前HPLC能够同时满足条件，并且当被测样品中含有两种或两种以上合成色素时，液相色谱法的优势更加突出，该方法在分析测定合成着色剂时已成为主要的有效方法[11-12]。对卷烟爆珠中的着色剂已有报道，张建铎[13]等建立了卷烟爆珠中柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、赤藓红、诱惑红、亮蓝7种合成着色剂同时检测的超高效液相色谱-串联质谱法，刘秀明[14]等利用高效液相色谱测定测定8种柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红合成着色剂。但对靛蓝和喹啉黄同时测定鲜少报道，由于喹啉黄为2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮单磺酸钠盐（QYNa）和 2-(2-喹啉基)-茚满基-1,3-二酮二磺酸二钠盐（QYNa2）的混合物。QYNa、QYNa2各存在两个同分异构体，QYNa、QYNa2保留时间差异较大，共有4个色谱峰前后出现，给分离带来了一定难度。本文通过样品前处理、色谱分离条件优化实验，建立了HPLC-PDA同时快速测定卷烟爆珠中10种合成着色剂（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红、靛蓝、喹啉黄）含量的方法，通过建立该种检测方法并测定含量，将为卷烟开发及安全评价提供参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

色谱仪系统：型号Waters e2695高效液相色谱仪（检测器配置Waters 2998二极管阵列），美国Waters公司生产；超纯水仪：型号Milli-Q（美国Millipore公司生产）；电子分析天平：型号AB204-S（瑞士Mettler-Toledo公司生产），精度为0.000 1 g；超声波水浴锅：频率40 kHz，功率400 W，加热功率320 W，温度可调室温～80 ℃（云南乐德科技生产）；过滤器：水相针式过滤器（0.45 µm）。

10种采购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH Company的合成着色剂标准品：赤藓红（纯度≥91.0%，0.25 g）、胭脂红（纯度≥89.8%，0.1 g）、柠檬黄（纯度≥92.5%，0.25 g）、酸性红（纯度≥87.4%，0.1 g）、亮蓝（纯度≥93.4%，0.25 g）、诱惑红（纯度≥83.0%，0.1 g）、喹啉黄（纯度≥90.2%，0.25 g）、苋菜红（纯度≥93.3%，0.25 g）、靛蓝（纯度≥89.0%，0.25 g）、日落黄（纯度≥87.0%，0.1 g）；广东汕头市西陇化工厂出产乙酸铵(分析纯)；美国 Fisher出产甲醇 (色谱纯)。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准母液

分别称取标准品酸性红、日落黄、柠檬黄、亮蓝、胭脂红、苋菜红、靛蓝、诱惑红、喹啉黄、赤藓红50 mg于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成浓度为1.00 mg/mL的水溶性合成着色剂标准储备溶液。

1.2.2 标准储备液

分别将标准溶液酸性红、日落黄、柠檬黄、亮蓝、胭脂红、苋菜红、靛蓝、诱惑红、喹啉黄、赤藓红移取2.5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成浓度为50 µg/mL的水溶性合成着色剂标准储备液。

1.2.3 混合标准溶液

准确移取水溶性合成着色剂标准储备液2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配置成10 µg/mL的水溶性合成着色剂混合标准溶液。

1.2.4 标准工作溶液

分别移取合成着色剂混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用水逐级稀释，得到浓度分别为0，0.50，1.0 ，2.5 ，5.0 ，7.5 ，10.0 µg/mL 的标准工作溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱 ：Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 µm)；流动相：A相为0.02 mol/L乙酸铵溶液，B相为乙腈，C相为甲醇，梯度洗脱，具体洗脱程序见表1；柱温：30 ℃；进样量 10 µL；流量为 0.6 mL/min；运行时间 35 min；DAD扫描范围：200～800 nm；定量检测波长：柠檬黄、喹啉黄427 nm，亮蓝、靛蓝625 nm，苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红、赤藓红511 nm。

表1 梯度洗脱程序

1.4 样品的处理

将爆珠从成品卷烟烟支嘴棒中剥离，用吸油纸包裹并挤破爆珠，将香精吸干，称取0.2 g壁材置于三角锥形瓶中，加入70 ℃超纯热水20 mL，进行超声提取20 min（超声水浴锅设置超声温度70 ℃，频率为40 MHz），静置分层后，用0.45 µm水相滤膜过滤下层水相溶液，制得待测液。每个样品平行测定两次，取平均值得到所测样品含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择和优化

2.1.1 检测波长的选择

利用PDA检测器在190～800 nm波长范围内对标准溶液进行扫描，将定性定量波长由各个物质最大的吸收波长选取，分别为柠檬黄427 nm、苋菜红511 nm、胭脂红511 nm、日落黄511 nm、诱惑红511 nm、亮蓝625 nm、酸性红511 nm、赤藓红529 nm，靛蓝625 nm，喹啉黄427 nm。

2.1.2 流动相的选择

酸性红、日落黄、柠檬黄、亮蓝、胭脂红、苋菜红、靛蓝、诱惑红、喹啉黄、赤藓红10种水溶性着色剂皆为溶于水的钠盐化合物，以甲醇-乙酸铵水溶液（0.02 mol/L）作流动相时，酸性红和亮蓝无法达到基线分离，以乙腈-乙酸铵水溶液（0.02 mol/L）作流动相时，日落黄和喹啉黄2无法分离。最终选择甲醇-乙腈-乙酸铵水溶液（0.02 mol/L）作流动相时，在优化的色谱条件下，10种着色剂混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 10种水溶性着色剂标准工作溶液的色谱图

2.1.3 色谱柱的选择

考察 ZORBX SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 µm)对10种着色剂的分离效果和色谱峰形，发现亮蓝和喹啉黄3不能完全分离，而色谱柱Phenomenex Luna®-C18 (4.6 mm×250 mm,5 µm)峰形不理想、而用 Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 µm)可使10种着色剂在柱上得到了较好的保留，从而得到理想的分离效果。

2.2 样品前处理条件的选择和优化

2.2.1 溶剂及溶剂温度选择

海藻酸钠基质和明胶基质分别是目前常用的两种爆珠壁材，海藻酸钠亲水性强，粘性高，可在温水及冷水条件下溶解，并形成均匀粘稠溶液，是一种高分子化合物。明胶则可以溶于热水，是一种天然生物高分子材料。基于两种基质对水温的溶解性质，将萃取溶剂选定为热水。

将明胶基质和海藻酸钠基质的爆珠分别称取3 份，在不同温度梯度（50 ℃、70 ℃、90 ℃）条件下进行提取，观察壁材溶解的状态以进行筛选，可知只有达到70 ℃以上条件时溶解才较充分，因此在超声波水浴锅中以恒定70 ℃热水为溶剂进行提取。

2.2.2 超声提取时间选择

各称取两种基质的爆珠各1份，对比在4个不同时间（5 min、10 min、20 min、30 min）的萃取效果，以壁材溶解状态为指标进行选择，在恒温水浴超声提取5 min的条件下，两种基质均无法得到清亮溶液，而在恒温水浴超声提取10 min的条件下，以明胶为基质的爆珠壁材可被完全溶解，得到清亮提取液；在20 min、30 min的时间条件下，海藻酸钠为基质的爆珠出现基质均匀散布于溶液中的现象，得到粘稠均匀溶液。基于上述结果，综合选择恒温水浴超声提取20 min。

2.2.3 溶剂量选择

将 2.2.1中的爆珠按 2种基质各称取 3份（0.2 g/份），精确至 0.000 1 g，分别加入 10 mL、20 mL、50 mL、80 mL 的热水，用恒温水浴（70～80 ℃）进行20 min超声提取，依据结果可见水溶性着色剂在20 mL体积时可被全部提取，因此选择20 mL作为萃取溶剂量。

2.3 方法的线性关系和检出限

分别将喹啉黄、酸性红、诱惑红、胭脂红、亮蓝、苋菜红、日落黄、赤藓红、靛蓝、柠檬黄的混合标准溶液进行调配（范围 0.2～25.0 µg/mL），绘制出以上述各个合成着色剂浓度为横坐标、与此相对应峰面积为纵坐标的标准曲线，而后通过回归分析，获取以上10种合成着色剂相对应的线性回归方程和相关系数，连续6次对最低浓度标准溶液进行测定，定量限设定为10倍标准偏差（S/N=10）；检出限设定为3倍标准偏差（S/N=3），可知以上10种合成着色剂的检出限（LOQ）范围位于0.9～11.0 mg/kg之间，定量限统计结果如表2所示。

表2 标准曲线和检测限1)

2.4 精密度与回收率

以典型检出的样品为指标，通过3水平加标方式开展精密度与回收率的检测实验，检测方法回收率与重复性的统计结果可见表3，由此可知回收率区间范围在82.1%～105.7%之间，相对标准偏差（RSD）区间范围在1.06%～5.70%之间。

表3 检测方法回收率与重复性(n=5)

2.5 实际样品分析

对16个爆珠样品进行分析（1（深绿色）、2（棕色）、3（玫红色）、4（深蓝色）、5（绿色）、6（橙色）、7（褐色）、8（黄色）、9（橘红色）；10（深蓝色）、11（蓝色）、12（天蓝色）、13（绿色）、14（淡黄色）、15（深蓝色）、16（深蓝色）），其中，1～9 号爆珠样品为海藻酸钠基质，10～16号爆珠样品为明胶基质。结果如表4所示，典型的爆珠壁材样品的HPLC色谱图如图2所示，所检测的10个合成着色剂指标（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性红、亮蓝、赤藓红、喹啉黄、靛蓝）中，苋菜红、诱惑红和靛蓝均未检出，柠檬黄、亮蓝检出率相对较高。

表4 实际样品中色素的检测结果1) mg/kg

图2 爆珠壁材样品HPLC色谱图

3 结束语

本文通过实验条件的筛选和改进，建立了对烟用爆珠的壁材内部同时测定10种水溶性着色剂的HPLC方法，目前已达到在35 min内可将10种目标物完全进行基线分离的效果。诸多参数（相对标准偏差、线性相关系数、回收率）分析结果均表明，基于实际样品的检测需求，该种方法在精确程度和灵敏程度上都能完全达到要求。因此在实际研发生产工作中，该方法可以对各种品牌、各种基质的烟用爆珠壁材开展检测和定量，以起到对卷烟产品研发和物料安评提供参考评价的作用。