酵母菌发酵生产赤藓糖醇的研究进展

程磊，宗朕，陈卓静，王磊，汪超，祁勇刚，柳志杰

(湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068)

赤藓糖醇是一种四碳糖醇，具有热量低，人体耐受性高，防龋齿，不引起血糖变化，改善肤质等优点，可以作为甜味剂添加到食品和日化消费品中[1,2]。赤藓糖醇同时还具有储热密度大、无腐蚀性、热稳定性好的理化性质，可用于制备优良的相变材料[3]。赤藓糖醇因其广阔的应用前景，逐渐被重视。目前主要通过化学法、微生物发酵法生产赤藓糖醇。化学法是将淀粉用高碘酸法生成双醛淀粉，在高温高压条件下，镍作为催化剂，双醛淀粉经氢化裂解成赤藓糖醇及其他衍生物[4]。另外，祁广宾等以葡萄糖钠为原料氧化、加氢制备赤藓糖醇[5]。但化学法存在流程长、成本高、产物选择性低、安全性差等诸多问题，而微生物发酵法具有反应温和、成本低廉、生产效率高等优点，因而更加广泛应用于赤藓糖醇的工业化生产，其中主要使用的菌种是耐高渗透酵母，包括Pichia(毕赤氏酵母属)，Candida(假丝酵母)，Torulopsis(球拟酵母属)，Trigonopsis(三角酵母属)，Moniliella(丛梗孢酵母属)，Trichospornides(丝孢酵母属)，Yarrowia(耶氏酵母属)，Hansenula(汉森(氏)酵母属)等[6]。本文主要从菌种选育、赤藓糖醇的合成途径、基因工程和发酵工艺四个方面阐述酵母菌生产赤藓糖醇的研究进展，为提升酵母菌生产赤藓糖醇的能力提供了参考，进而推动了微生物发酵生产赤藓糖醇产业的发展。

1 赤藓糖醇特性

赤藓糖醇的化学名是1，2，3，4-丁四醇，分子式为C4H10O4，白色无味晶体，赤藓糖醇吸湿性低，结晶性好，易粉碎制得粉状产品，其吸湿性在糖醇及蔗糖等甜味剂中是最小的。赤藓糖醇的熔点为118～122 ℃，沸点为329～331 ℃，热稳定性高，即使在160 ℃高温环境中也不发生分解及变色，避免了食品在高温加工过程中出现焦化，并且在pH 2～12的条件下稳定，符合一般食品对酸碱的要求。因为赤藓糖醇化学结构中无羰基，所以在与氨基酸共存的条件下不发生美拉德反应。其甜度约为蔗糖的75%，甜味纯正，后味消失快，与其他甜味剂复配使用，如乙酰碘氨酸钾、天冬酰苯氨酸甲酯等，能改善、协调味质的作用[7]。赤藓糖醇实际为人体提供的热量值在诸多糖醇类甜味剂中是最低的，被人体吸收后的赤藓糖醇分子不能被机体内的酶系统分解，不为机体提供热量，不参与糖代谢引起血糖变化，只能透过肾脏从血液滤出，随尿液从人体排出。赤藓糖醇的生物耐受性高，安全无毒，无致畸、致癌、诱导染色体变异等副作用[8]。赤藓糖醇不能被口腔中的变异链球菌等细菌发酵利用，不会导致口腔中pH的变化，不会产生牙菌斑，而且赤藓糖醇能抑制口腔链球菌的生长和生物膜的形成,因而赤藓糖醇可以降低龋齿风险[9]。

2 生产赤藓糖醇的酵母菌选育

酵母菌与霉菌、细菌相比，其安全性、赤藓糖醇生产能力和产物选择性占有明显优势，因而酵母菌是比较适合生产赤藓糖醇的菌种，工业上生产赤藓糖醇的菌种大部分是酵母菌。产赤藓糖醇的野生型酵母主要是从土壤、花粉、蜂蜜、蜂巢和发酵食品中分离获得，然后对野生型菌种筛选、纯化、诱变育种获得高产赤藓糖醇的酵母菌。1950年，Binkley等首次发现酵母菌生产赤藓糖醇[10]。1956年，Spencer 等在研究耐高渗酵母产甘油时，发现酵母菌的培养条件与生长速度的改变，可生产赤藓糖醇[11]。1964年，Hajny等从新鲜花粉中分离出1株圆酵母(Torulasp.) ，赤藓糖醇转化率可达到 35%～40%。1998年，Park 等从蜂巢中分离得到的耐高渗酵母(Trichosporonsp.)，赤藓糖醇产量可达到209 g/L[12，13]。2001年，Shie-Jea Lin等从花粉和蜂蜜中分离出6株产赤藓糖醇的耐高渗透酵母，其生产赤藓糖醇的转化率达37%。2010年，Shie-Jea Lin等又从蜂蜜中分离出1株高产赤藓糖醇的丛梗孢酵母(Moniliellasp.)，但该菌种对赤藓糖醇有较强的吸收能力[14]。然后该课题组采用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱变后筛选得到N61188-12,该菌株对赤藓糖醇的吸收较弱，在2000 L的发酵罐中经过10天发酵，赤藓糖醇产量达189.4 g/L[15]。2008年，Waldemar Rymowicz等筛选的突变型Y.lipolyticaWratislavia K1,赤藓糖醇的产量达170 g/L,转化率为56%。2014年，Waldemar Rymowicz等进一步采用紫外线诱变Wratislavia K1，得到突变型菌株MK1，其赤藓糖醇的最高产量为224 g/L,转化率为77%，而所得到的副产物总量低于2.3%[16]。2016年，Liu Xiaoyan等通过常压室温等离子体突变系统诱变野生型Y.lipolyticaSWJ-1b,随后从该株菌的突变菌株中筛选出了菌种M53，生产赤藓糖醇的转化率达64.8%[17]，而且菌种M53能够将废弃的食用油作为碳源生产赤藓糖醇，降低了生产成本[18]。

国内对于产赤藓糖醇菌种的研究较晚，徐虹等、范光先等、吴燕等、叶娴等、王凤伟等从不同材料中分离得到的产赤藓糖醇的酵母菌，但赤藓糖醇的产量和转化率均偏低[19-23]。

3 赤藓糖醇的合成途径

酵母菌能够分别利用葡萄糖和甘油合成赤藓糖醇，其中葡萄糖主要来源于淀粉质原料的酶解，获取成本较高。甘油可作为副产物从生物燃料生产过程中获取，成本低廉，而且所具备的高渗透压特性能增强酵母菌生产赤藓糖醇的能力[24],酵母菌以甘油为基质生产赤藓糖醇的代谢途径复杂，其中涉及的酶和中间产物较多，此代谢途径有更大的研究潜力。以下分别介绍酵母菌以葡萄糖和甘油为基质生产赤藓糖醇的代谢途径。

酵母菌生产赤藓糖醇的主要途径是在需氧条件下，通过磷酸戊糖途径生产赤藓糖醇，见图1。

图1 酵母菌利用葡萄糖生产赤藓糖醇

葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后在转酮酶的催化下转化为4-磷酸赤藓糖，进一步在4-磷酸赤藓糖激酶的去磷酸化作用下生成赤藓糖醇，最后在赤藓糖还原酶催化加氢作用下生成赤藓糖醇[25]。

酵母菌通过磷酸化途径利用甘油生产赤藓糖醇[26]。在发酵底物中，作为碳源的甘油被甘油激酶磷转化为甘油-3-磷酸，进一步脱氢形成二羟丙酮磷酸,然后在异构酶和转酮醇酶的作用下转化为赤藓糖-4-磷酸和其他代谢产物，经过磷酸戊糖途径，脱磷酸生成赤藓糖，最终在赤藓糖还原酶的作用下脱氢形成赤藓糖醇，见图2。

图2 酵母菌利用甘油生产赤藓糖醇

在该代谢途径中，转酮醇酶是关键性的酶，对赤藓糖-4-磷酸的代谢量有显著的影响，进而影响赤藓糖醇的最终产量[27]。

4 基因工程改造酵母菌

酵母菌在利用甘油合成赤藓糖醇的途径中存在许多关键性的酶，如转酮酶、转醛醇和赤藓糖醇还原酶等，对酵母菌的赤藓糖醇产量有极大的影响[28]。采用基因工程的方法对产赤藓糖醇的酵母基因序列的修饰，影响相关酶的基因表达量，最终可以实现增加赤藓糖醇的生产量和转化率的目的。近年来，研究者还发现了酵母菌以赤藓糖醇作为碳源表达的关键基因，敲除该基因进一步增加了酵母菌的赤藓糖醇最终产量[29,30]。

Dorota A Rzechonek等发现突变型Y.lipolyticaWratislavia K1无法分解利用赤藓糖醇，但是Wratislavia K1的突变型菌株MK1能在赤藓糖醇作为唯一碳源的培养基上生长。采用反转录PCR分析MK1，显示突变型菌株MK1中基因EUF1(YALI0F01562g)表达量显著增加。进一步敲除了菌株AMM(由MK1衍生)中基因序列EUF1，发现菌株AMM无法在赤藓糖醇为碳源的培养基中生长，确定了EUF1是酵母菌利用赤藓糖醇的关键基因序列。Carly F等在研究中证实了酵母中的基因EYK1(YALI0F01606g)是酵母菌分解利用赤藓糖醇的关键基因，该基因表达赤藓酮糖激酶。Tomasz Janek等超量表达酵母菌中编码赤藓糖还原酶的基因(YALI0F18590g)，赤藓糖醇的最终产量比对照组高20%[31]。Aleksandra M等构建了工程菌AJD pADUGut1/2，同时超量表达基因GUT1(表达甘油激酶)和GUT2(表达甘油-3-磷酸脱氢酶)，增加了赤藓糖醇代谢途径中的中间体，该株菌的赤藓糖醇产量比对照组增加了35%[32]。Frédéric Carly等重新构建的菌株FCY214，超量表达基因GUT1(表达甘油激酶)、TKL1(表达转酮醇酶)，比母本菌株的生产速率提升了75%，然后敲除了FCY214中基因EYK(表达赤藓酮糖激酶)，使该菌种无法利用赤藓糖醇作为碳源[33]。

5 发酵工艺

优质菌种是生产目的产物的重要因素，优良的发酵工艺则能进一步提升发酵产物的产量和生产效率。近年来，研究者们对赤藓糖醇发酵工艺的研究主要集中于培养基组分和渗透压。

5.1 培养基组分

Ludwika Tomaszewska等研究了酵母提取物、胰蛋白胨、(NH4)SO4、玉米浆等作为氮源和维生素来源对Y.lipolyticaWratislavia K1生产赤藓糖醇过程的影响，发现酵母提取物是Wratislavia K1的最佳氮源和维生素来源。Wratislavia K1在325 kg/m3的高浓度底物分批发酵168 h后，赤藓糖醇的产量达325 kg/m3，并且在消耗了部分甘油后添加酵母提取物，副产物明显减少，其总量没有超过10%[34]。Rywinska,Anita等采用响应面分析法优化了菌种Wratislavia K1的培养基组分，(NH4)SO4,KH2SO4,NaCl添加量分别为2.25,0.22,26.4 g/L，碳氮比例为81∶1。菌株Wratislavia K1在添加了100 g/L甘油的该培养基中，赤藓糖醇的生产量为46.9 g/L，转化率为47%[35]。Magdalena Rakicka等研究的结果显示Y.lipolyticaMK1以甘为碳源的培养基中最适碳氮比例是80∶1，在该条件下，菌种MK1生产赤藓糖醇的最高产量为113.1 g/L，转化率为58%[36]。

此外，在培养基中添加辅助物质能提升酵母菌生产赤藓糖醇的能力。过高的渗透压会抑制酵母生长，甚至使发酵过程停滞，降低赤藓糖醇的生产率[37]。杨利博等向培养基中添加甘氨酸、脯氨酸协助酵母菌抵抗高渗透压，显著减轻了高渗透压对酵母菌生长的抑制效果，提升了赤藓糖醇的生产能力[38]。Ludwika Tomaszewska首次研究了铜、铁、锰、锌离子对Y.lipolytica生产赤藓糖醇能力的影响，其中锰离子促进作用最显著，菌株Wratislavia K1在添加了锰离子的培养基中赤藓糖醇的生产量比对照组提升了14.5%，赤藓糖还原酶活力提升至对照组的1.3倍[39]。表面活性剂能提升细胞膜通透性，进而提升菌种代谢产物的生产量，Magdalena Rakicka等对比了3种表面活性剂Triton X-100,Span 20和Tween 80对菌株Wratislavia K1生产赤藓糖醇的影响，结果显示Span 20组的赤藓糖醇产量比对照组提升了15%[40]。

5.2 渗透压

高渗透压环境有利于酵母菌合成赤藓糖醇,但是其中的机理及渗透压的控制模式尚处于研究阶段。Yang Li-bo等在Y.lipolytica分批补料式发酵生产赤藓糖醇中，首次采用了1种NaCl控制两阶段渗透压的策略。第一阶段(0～96 h)维持渗透压处于4.25 osmol/kg的较低水平以减少对菌体生长的抑制，第二阶段(132～196 h)控制渗透压至4.94 osmol/kg使赤藓糖醇的生产速率保持高水平，赤藓糖醇的最高产量和生产速率比第一阶段分批补料发酵提升了25.7%，2.2%，达到了194.3，0.95 g/L/h。Ludwika Tomaszewska-Hetman等进一步研究了高渗透压Y.lipolytica的影响，菌株A-3以甘油为基质，置于75 g/dm3NaCl的高渗透压环境中，甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶的活力分别下降了78%，25%，而转酮醇酶和赤藓糖还原酶的活力没有变化。Yang Li-bo 等通过分析Y.lipolytica在高渗透压环境中，与能量、新陈代谢、细胞修复、应激反应等相关的54种蛋白质，该课题组发现Y.lipolytica在高渗透压环境中能提升赤藓糖醇的生产能力主要是因为高渗透压引起转酮醇酶、磷酸丙糖异构酶和渗透压应激蛋白类的表达显著增强[41]。

6 展望

目前研究者已经通过自然选育和诱变育种筛选出具备高产量和高产率的优良酵母菌菌种，并且优化了发酵工艺，进一步提高了赤藓糖醇的产量。但是高渗透压对酵母菌合成赤藓糖醇影响机理的研究依然停留在相关蛋白质水平,后续可以结合基因工程和代谢组学深入研究，鉴定其中涉及的酶及基因，对酵母菌合成赤藓糖醇的代谢途径进行更加精准的调控，提高赤藓糖醇的产量。