异丁醇萃取三种酶解产物苦味肽的研究

杨昭，姚玉静*，黄佳佳，韩晋辉，梁志理，崔春

(1.广东食品药品职业学院 食品学院，广州 510520；2.广东食品药品职业学院实验实训中心，广州 510520；3.华南理工大学 轻工与食品学院, 广州 510640)

蛋白质酶解产物富含小肽和氨基酸，具有鲜味突出、口感饱满、风味浓郁、营养丰富、生物效价高的特征，是制备风味调味品、调味料、呈味基料、营养液的重要原料[1-3]。为获得高质量的酶解产物，通常将蛋白质通过酶充分水解。但水解度高的蛋白质酶解产物具有苦味，其成因主要是含有苦味肽成分[4]。酶解产物的苦味制约了其在食品和保健品工业领域中的应用[5]。目前降低或脱除酶解产物苦味肽的方法，主要包括选择性分离、化学成分掩盖、微生物端化酶处理、美拉德反应等[6]。然而也有研究表明苦味肽具有一定的生物活性，如具有ACE 抑制活性的as1酪蛋白1～9片断[7]。因此，将苦味肽选择分离并进行结构鉴定是探究其脱除机制和其生物活性应用的重要前提。

目前分离苦味肽的方法主要有大孔树脂、超滤、纳滤、有机试剂萃取、凝胶色谱、离子交换色谱、电泳等[8-10]。其中有机试剂萃取法为快速大规模分离苦味肽的良好方法，可以避免其他方法耗时长、耗费大、操作繁琐、分离肽种类少等缺点。有机试剂萃取法常用的溶剂为异丁醇、氯仿、甲醇、乙醇、丙醇等，其中用异丁醇萃取的方法较多。Lalasidis等[11]最早研究发现异丁醇能有效萃取出酶解产物中的苦味肽。周俊清等[12]也发现用50%异丁醇可完全萃取出酪蛋白酶解产物中的苦味肽。牡蛎、鸡肉和南极磷虾富含蛋白质，为重要的蛋白质资源，其酶解产物具有较高的营养价值和商业价值。在研究其酶解过程中发现，随着水解度的增大，酶解产物具有苦味。为探究酶解过程中苦味肽的产生机理及其生物活性，需要对苦味肽进行快速分离。目前未有文献报道采用异丁醇萃取牡蛎、鸡肉、南极磷虾酶解产物中的苦味肽。

本研究以牡蛎、鸡肉和南极磷虾为原料，采用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合蛋白酶酶解原料，通过异丁醇萃取酶解产物中的苦味肽，探究异丁醇萃取苦味肽过程中感官和肽分子量分布的变化，以期寻找一种快速分离3种酶解产物中苦味肽的方法，为牡蛎、鸡肉和南极磷虾酶解产物中苦味肽的脱除及其生物活性的研究提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜近江牡蛎：购于广州黄沙水产市场，开壳，取肉，清洗，搅碎均匀后分装于封口袋中，-18 ℃冻藏备用；新鲜清远鸡肉：购于广州龙洞上社市场，取鸡胸肉搅碎均匀后分装于封口袋中，-18 ℃冻藏备用；南极磷虾：由青岛东风远洋渔业有限公司提供，搅碎均匀后分装于封口袋中，-18 ℃冻藏备用。

胰蛋白酶(酶活 4000 U/g)：购于重庆市全新祥盛生物制药有限公司；风味蛋白酶(酶活 500 LAPU/g)：诺维信中国公司；维生素B12(MW 1855 U)、抑肽酶(MW 6512 U)、细胞色素C(MW 12384 U)、卵清蛋白(MW 43000 U)：美国Sigma公司；食用盐、味精、蔗糖、柠檬酸：食品级；其他试剂：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱 日本岛津制作所；S220 酸度计、TLE104E分析天平 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；K9840凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DKZ-3B水浴振荡培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解产物制备

冻藏原料置于室温溶解后，根据原料的质量按照1∶1的比例加入相应重量的蒸馏水，搅拌均匀，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0(酶解过程中每隔2 h调1次pH，确保pH维持在7.0)，添加牡蛎重量0.4%的胰蛋白酶和0.2%的风味蛋白酶，在温度为55 ℃的水浴条件下酶解20 h。酶解结束后沸水浴20 min灭酶，8000 r/min离心20 min，取上清液即为酶解产物，-18 ℃冻存备用。

1.3.2 异丁醇萃取苦味肽

参照文献[13,14]，取50 mL酶解产物，冷冻干燥至粘稠状，加入50 mL 80%乙醇，室温状态下搅拌萃取30 min，然后离心(8000 r/min，10 min)收集醇溶部分。通过旋转蒸发去除乙醇，浓缩物用10 mL蒸馏水复溶，溶液冷冻干燥后即为80%乙醇萃取物，-18 ℃冻藏备用。取2 g 80%乙醇萃取物用50 mL蒸馏水溶解，再加入50 mL 异丁醇，室温状态下搅拌萃取10 min，转移至分液漏斗中静置，待液体分成清晰的两层后，将下层萃取相通过漏斗下口放出，通过55 ℃旋转蒸发浓缩后，用10 mL蒸馏水复溶即为异丁醇萃取乙醇相下清液。上层萃取物从漏斗口倒出，通过55 ℃旋转蒸发浓缩后，用10 mL蒸馏水复溶即为异丁醇萃取乙醇相上清液。

1.3.3 水解度测定

总氮含量根据GB 5009.5-2010测定。氨基酸态氮含量根据甲醛滴定法测定[15]。水解度(DH)按照下式进行计算：DH(%)=W1/W×100%，式中：W1为氨基酸态氮含量，g；W为原料总氮含量，g。

1.3.4 感官评定

根据文献[16]，选取7名感官评定员在感官评价室进行感官评定。感官评定员在评定之前经过基本滋味培训，进行培训的标准品分别是酸味(0.04%柠檬酸)、甜味(1%蔗糖)、苦味(0.02 g/L盐酸奎宁)、咸味(0.35%食用盐)、鲜味(0.2%味精)。使用5点线性坐标，将标准品梯度稀释，最高浓度为10分，最低浓度为2分，每稀释1个梯度，感官分值降低2分。样品配制为固形物浓度为10%的溶液，采用滋味特征描述与感官定量分析对样品进行感官评定。评定步骤：评定员从低浓度至高浓度逐一品评某一滋味各稀释梯度标准液并记录滋味强度，标准液在口中停留15～20 s，之后吐掉，蒸馏水漱口，取5 mL测试样液放于口中，样液在口中停留15～20 s，之后吐掉，根据样品与各稀释梯度标准液滋味强度的相近性进行打分，同时用文字记录样品滋味特征。

1.3.5 肽分子量分布测定

根据文献[17]，将样品稀释至蛋白浓度为1 mg/mL，通过0.22 μm滤膜过滤，使用高效液相色谱测定样液中肽分子量分布情况，洗脱液为0.04 mol/L磷酸缓冲液，流速为 1 mL/min，检测波长为220 nm，凝胶柱为TSk gel G2000 SWxL(300 mm×7.8 mm，5 μm)。标准肽样品分别为：卵清蛋白(MW 43000 U)、细胞色素C(MW 12384 U)、抑肽酶(MW 6512 U)、维生素B12(MW 1855 U)。根据标准肽样品的洗脱时间得到标准曲线方程：y=-0.3383x+7.3451(R2=0.9917)。

式中：y为分子量的对数，u；X为保留时间，min。

1.3.6 数据分析

所有的实验均进行3次。统计分析采用Excel 2010软件进行，数据采用平均数±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 酶解产物水解度分析

图1 酶解产物水解度Fig.1 Hydrolysis degrees of enzymatic hydrolysates

水解度是衡量蛋白质酶解程度的指标。水解度过低，蛋白质的空间结构未被破坏，疏水性基团不能与味蕾接触产生苦味；水解程度过高，蛋白质完全被水解成为游离氨基酸，抑制了与苦味受体的结合，也不能产生苦味。因此，水解度对蛋白质酶解产物的苦味有重要影响[18]。为获得富含小肽和游离氨基酸的酶解产物，尽可能将大分子蛋白质水解，采用水解效率高的胰蛋白酶和水解风味好的风味蛋白酶组成复合蛋白酶深度酶解原料。由图1可知，复合蛋白酶分别酶解牡蛎、鸡肉和南极磷虾，均可达到较高的水解度，分别为51.77%，39.22%和50.54%。同样的酶解条件下，牡蛎和南极磷虾酶解产物的水解度非常接近，但高于鸡肉。文志州[19]采用复合酶对新鲜牡蛎进行酶解，得到最大水解度为40.71%。张永生等[20]采用复合酶水解鸡胸肉，得到最大水解度为20.04%。黄艳青等[21]采用木瓜蛋白酶水解南极磷虾，得到最大水解度为44.24%。本试验各原料酶解产物水解度均高于文献所报道的。因此，可推断酶解产物中含有丰富的小肽和游离氨基酸。

2.2 异丁醇萃取3种酶解产物苦味肽的滋味特性

酸、甜、苦、咸和鲜为人类的5种基本味觉，产生的机理是溶解于水或唾液中的呈味成分刺激味蕾，信号传导至大脑皮层产生兴奋或味觉[22]。苦味的产生主要是多肽片段中疏水性氨基酸与人体苦味受体相互作用的结果。人的感官评定是目前鉴定苦味肽最常用、有效和直观的方法。因此通过感官分析，可为筛选苦味肽提供重要的依据。

表1 异丁醇萃取3种酶解产物苦味肽过程中组分的感官评定Table 1 Sensory evaluation of the components in the process of extracting 3 kinds of hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

图2 异丁醇萃取牡蛎酶解产物苦味肽过程中组分滋味特性雷达图Fig.2 Radar map of the components in the process of extracting oyster hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

图3 异丁醇萃取鸡肉酶解产物苦味肽过程中组分滋味特性雷达图Fig.3 Radar map of the components in the process of extracting chicken hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

图4 异丁醇萃取南极磷虾酶解产物苦味肽过程中组分滋味特性雷达图Fig.4 Radar map of the components in the process of extracting Antarctic krill hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

通过感官描述分析发现酶解产物与不同溶剂处理产物具有明显不同的滋味。由表1和图2可知，牡蛎酶解产物滋味复杂，具有鲜味和咸味，鲜味评分值为4.8分，咸味评分值为2.8分，苦味评分值较低，为2.0分。经过80%乙醇萃取后，上清液具有鲜、咸、酸味，鲜味评分值为6.4分，苦味评分值为0.8分。乙醇相再通过异丁醇萃取，上清液具有明显苦味，苦味延迟性长，苦味评分值达到6.8分，与0.005 g/L盐酸奎宁的苦味在感官上较一致。而下清液滋味平淡，具有微弱鲜味，苦味评分值为0.4分，基本无苦味。

由表1和图3可知，鸡肉酶解产物具有浓郁的鸡肉风味，滋味厚重，鲜味明显，具有良好滋味的鲜味和甜味评分值分别为8.3，4.0分，而苦味评分值为0分。这可能是由于较多的鲜味和甜味成分掩盖了苦味。Kim等在研究中也发现韩国酱油中的鲜味成分能够抑制人类苦味受体细胞的表达，可抑制苦味成分的苦味[23]。鸡肉酶解产物经过80%乙醇萃取后，上清液具有微弱鲜味、酸味和苦涩味，鲜味、酸味、苦味评分值分别为4.6，3.3，1.4分。乙醇相通过异丁醇萃取后，上清液具有微弱的苦味，苦味评分值为4.4分，与0.0025 g/L盐酸奎宁的苦味在感官上较一致；下清液滋味平淡，具有微弱的鲜味和咸味，苦味评分值为0.8分，基本无苦味。

由表1和图4可知，南极磷虾酶解产物具有浓郁的海鲜风味和明显的鲜甜滋味，鲜味和甜味评分值分别为7.4，2.9分，苦味评分值为0.4分。经过80%乙醇萃取后，上清液具有较强鲜味和明显的海鲜风味，鲜味评分值为6.5分，苦味评分值为0.3分。乙醇相通过异丁醇萃取后，上清液具有微弱苦味，苦味延迟性长，苦味评分值为5.0分，感官评判苦味值在0.0025～0.005 g/L盐酸奎宁之间；下清液滋味平淡，具有极弱的鲜味。

由以上研究可看出异丁醇萃取3种酶解产物的上清液均具有一定的苦味，这与仲丁醇萃取鳕鱼肉酶解液上清液具有明显苦味值的结果一致。据此分析，异丁醇萃取物中含有大量疏水性的苦味肽。

2.3 异丁醇萃取3种酶解产物苦味肽的分子量分布

分子量分布是肽类产物的重要特征性指标，直接反映产物中不同大小分子量肽类的构成[24]。肽类的苦味与其相对分子量密切相关，分子量大于5 ku的肽无苦味，只有分子量小于5 ku的肽才可能会显现出苦味，且分子量介于500～1000 ku的短肽苦味最强[25]。付光中等研究也发现虾头自溶产物的苦味主要来自分子量为3～5 ku的肽[26]。宋雪梅等采用液相色谱-串联质谱从干酪中鉴定出的14种苦味肽均是分子量小于2 ku的肽[27]。

凝胶色谱是根据多肽分子的大小、形状差异进行分离的一种方法。根据分子筛原理，分子量大的部分出峰时间早，保留时间短；分子量小的部分出峰时间晚，保留时间长。本试验中经凝胶液相色谱分析后，标准肽样品与出峰时间拟合直线方程为y=-0.3383x+7.3451，R2=0.9917，表明各标准肽样品的相对分子量对数与洗脱时间呈现良好的相关性，可以准确地测定样品中多肽的分子量分布。

图5 异丁醇萃取牡蛎酶解产物苦味肽过程中组分的肽分子量分布Fig.5 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting oyster hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：M1为酶解产物;M2为80%乙醇萃取物;M3为异丁醇萃取乙醇相上清液;M4为异丁醇萃取乙醇相下清液。

谱图按分子量大小连续分布，表明各组分为各种大小不等、长短不一的肽和氨基酸的混合物。由图5可知，牡蛎酶解产物中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例为93%，其中小于1 ku的多肽占36.55%，1～3 ku的多肽占36.98%。经过80%乙醇萃取，上清液中小于5 ku的多肽比例为83.64%，其中小于1 ku的多肽占30.90%，1～3 ku的多肽占14.78%，3～5 ku的多肽占37.97%。乙醇相通过异丁醇萃取后，上清液中小于5 ku的多肽比例达到94.86%，其中小于1 ku的多肽占57.41%，1～3 ku的多肽占15.84% ，3～5 ku的多肽占21.62%；下清液中小于5 ku的多肽比例为77.67%，其中小于1 ku的多肽占24.23%，1～3 ku的多肽占13.12%，3～5 ku的多肽占40.32%。

图6 异丁醇萃取鸡肉酶解产物苦味肽过程中组分的肽分子量分布Fig.6 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting chicken hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：J1为酶解产物; J2为80%乙醇萃取物; J3为异丁醇萃取乙醇相上清液; J4为异丁醇萃取乙醇相下清液。

由图6可知，鸡肉酶解产物中多肽分子量分布小于5 ku的比例为75.28%，其中小于1 ku的多肽占24.16%，1～3 ku的多肽占25.23%，3～5 ku的多肽占25.60%。经过80%乙醇，上清液中小于5 ku的多肽比例为86.82%，其中小于1 ku的多肽占30.53%，1～3 ku的多肽占28.39%，3～5 ku的多肽占27.90%。乙醇相通过异丁醇萃取后，上清液中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例达到97.61%，其中小于1 ku的多肽占67.58%，1～3 ku的多肽占19.49%，3～5 ku的多肽占10.54%；下清液中小于5 ku的多肽比例为80.24%，其中小于1 ku的多肽占25.26%，1～3 ku的多肽占27.91%，3～5 ku的多肽占27.07%。

图7 异丁醇萃取南极磷虾酶解产物苦味肽过程中组分的肽分子量分布Fig.7 Peptide molecular weight distribution of the components in the process of extracting Antarctic krill hydrolysates' bitter peptides with isobutanol

注：L1为酶解产物; L2为80%乙醇萃取物; L3为异丁醇萃取乙醇相上清液; L4为异丁醇萃取乙醇相下清液。

由图7可知，南极磷虾酶解产物中多肽分子量分布小于5 ku的比例为76.83%，其中小于1 ku的多肽占29.68%，1～3 ku的多肽占20.81%，3～5 ku的多肽占26.33%。经过80%乙醇萃取，上清液中小于5 ku的多肽比例为87.86%，其中小于1 ku的多肽占34.11%，1～3 ku的多肽占23.30%，3～5 ku的多肽占30.44%。乙醇相通过异丁醇萃取后，上清液中多肽分子量分布主要集中在5 ku以下，比例达到97.44%，其中小于1 ku的多肽占58.89%，1～3 ku的多肽占23.41%，3～5 ku的多肽占15.14%；下清液中小于5 ku的多肽比例为80.73%，其中小于1 ku的多肽占29.27%，1～3 ku的多肽占21.44%，3～5 ku的多肽占30.02%。

由以上结果分析可知，酶解产物通过80%乙醇萃取后可获得丰富的多肽信息，上清液中多肽分子量分布均衡，各种分子量大小片段都存在。乙醇相再经过异丁醇萃取，上清液中主要是小于5 ku的多肽片段，3种酶解产物异丁醇萃取上清液均含有>94%的小于5 ku和>57%小于1 ku的多肽片段。

3 结论

采用复合蛋白酶深度酶解牡蛎、鸡肉、南极磷虾，获得高水解度的酶解产物。通过80%乙醇分别萃取3种酶解产物，再通过异丁醇萃取乙醇相，萃取上清液可获得丰富的苦味肽。异丁醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾乙醇相上清液感官评定都具有苦味，苦味评分值分别为6.8，4.4，5.0分。3种酶解产物异丁醇萃取乙醇相上清液均含有>94%的小于5 ku和>57%小于1 ku的多肽片段。本研究为快速萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾酶解产物中的苦味肽提供了新的方法，为后续苦味肽的质谱鉴定奠定了基础。