发酵豆酱中ACE抑制肽的制备及分离纯化

李利军，马英辉，卢美欢

(陕西省微生物研究所，西安 710043)

血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)是血管内膜细胞的一种糖蛋白[1]，相对分子质量为120～150 kDa[2]，通过影响肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)和激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system, KKS)而引起血压升高[3]。

20世纪80年代日本就对ACE抑制肽进行了深入的研究。近年来，食源性的ACE抑制肽也成为我国研究的热点，其中大豆因蛋白质含量高，富含人体所需的8种必需氨基酸，成为制备ACE抑制肽的优选原料。利用戊糖片球菌发酵大豆，获得了低分子量的大豆多肽，对ACE的抑制率达65.1%左右[4]。Naoyoshi等[5]从豆浆提取物中发现了具有ACE抑制活性的多肽。刘文颖等[6]利用酶解法从大豆低聚肽中获得了抗氧化肽和ACE抑制肽，并对其进行了鉴定。

本实验室前期研究中,从细菌型豆豉中已经筛选到1株枯草芽孢杆菌BS90,能以大豆蛋白为底物，产生ACE抑制肽，相继研究了制备高抑制活性大豆ACE抑制肽的优化实验，在最佳条件下，培养40 h，大豆蛋白水解度达到89.1%，ACE抑制率达81.8%。在本实验中，通过微生物发酵大豆，制得中国传统黄豆酱。经过研磨、水溶，采用盐析、超滤、柱层析对发酵制备豆酱中的混合多肽进行分级分离，并分别测定ACE抑制活性,流程图见图1。

图1 ACE抑制肽纯化流程Fig.1 The purification process of ACE inhibitory peptide

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

培养基：斜面培养基：LB；液体种子培养基：1%大豆分离蛋白，2%葡萄糖，0.5%氯化钠，定容于1000 mL，pH自然。

主要原料：黄豆，购于西安市紫燕食品有限公司。

主要试剂：血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酸(标准品)、马尿酰-组胺-酰亮氨酸(HHL，标准品)：美国Sigma公司；L-亮氨酸(分析纯)；邻苯二甲醛(OPA，分析纯)、三氯乙酸(分析纯)、甲醇(分析纯)、乙腈(分析纯)：天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；安捷伦1260高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 美国安捷伦公司；DHZ-D恒温摇床 江苏太仓仪器设备厂；DH-250A电热恒温培养箱 北京科伟仪器公司；Sigma3K15冷冻离心机 德国Sigma公司；HD-5紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂有限公司；超滤仪 美国Milli Power 公司；Sephadex G-75凝胶柱(1.6 cm×75 cm)；DEAE高流速琼脂糖微球a离子交换柱(2.6 cm×20 cm)；C18柱(4.6 mm×250 mm)。

1.3 方法

1.3.1 黄豆酱制作

将保藏菌株BS90斜面活化24 h，接种于液体种子培养基中，温度35 ℃、150 r/min摇床培养18 h。

取黄豆1000 g，用自来水浸泡10 h，空去水分，入高压灭菌锅蒸煮：1.1～1.3 Pa灭菌20 min，自然冷却后接种上述培养的液体种子，搅拌均匀入恒温箱32 ℃培养42 h，检测其水分、蛋白酶活力。然后拌15%盐水，补足水分为62%，食盐为6%，置于40 ℃发酵15天，黄豆酱制作完成。

1.3.2 ACE抑制肽粗品制备

称取黄豆酱50 g,用500蒸馏水溶解、过滤，得到ACE抑制肽粗品。

1.3.3 ACE抑制肽的分离纯化

将ACE抑制肽粗品进行8000 r/min 离心5 min，取上清液，30 ℃磁力搅拌，缓缓加入50%硫酸铵，溶解后置于4 ℃进行蛋白沉淀过夜。10000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用pH为7.4的缓冲液(Tris-HCl)溶解，置于4 ℃透析过夜。取出后进行8000 r/min离心5 min，对上清液进行超滤，超滤膜依次采用30，10，3，1 k，超滤后进行超滤管浓缩，高效液相色谱测定各个组分的活性，将活性最好的组分进行后期的色谱柱分离。

DEAE高流速琼脂糖微球a离子交换柱分离：平衡液为双蒸水，用NaCl(0.1～0.8 mol/L)、缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱速度为 1.0 mL/min，上样量为8 mL，在 280 nm 下收集各峰，检测活性，收集活性最高的组分备用。

Sephadex G-75 凝胶柱分离纯化：洗脱液为Tris-HCl，洗脱速度为 0.1 mL/min，上样量为20 mL，在280 nm下收集各峰，检测活性，收集活性最高的组分于冰箱冷冻保存。

1.3.4 检测方法

1.3.4.1 蛋白酶活力测定

按SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》执行。

1.3.4.2 水分测定

按GB/T 5009.3-2003执行。

1.3.4.3 氨基酸态氮、总酸、NaCl测定

按GB/T 5009.40—2000规定执行。

1.3.4.4 ACE活性检测方法[7]

发酵液中ACE抑制活性测定采用高效液相色谱法，其检测条件：C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)；检测波长228 nm；柱温20 ℃；流动相：水∶甲醇为40∶60(均含0.1%甲酸，V/V)；流速0.8 mL/min；进样量10 μL。

马尿酸标准曲线的绘制：分别配制马尿酸浓度为0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L的标准溶液，过0.22 μm的滤膜后，采用高效液相色谱法检测马尿酸含量，以峰面积(y)为纵坐标，马尿酸浓度(x)为横坐标绘制马尿酸标准曲线。

样品中马尿酸的测定： 50 μL HHL溶液、20 μL发酵上清液、50 μL ACE溶液，于37 ℃恒温水浴中反应30 min，加入120 μL 乙腈终止反应，振荡10 s，离心10 min，取上清液10 μL过0.22 μm的滤膜，待测。以缓冲液替代反应体系中的发酵上清液为空白对照组。

2 结果与分析

2.1 中性蛋白酶活力测定结果

中性蛋白酶活力测定结果见表1。

表1 中性蛋白酶活力测定结果Table 1 Determination of neutral protease activity

由表1 可知，曲料生长过程中，水分逐渐递减，蛋白酶活力前期随着菌丝生长，酶活力增加，在培养28～32 h时达到最高，之后水分递减，酶活力也随之下降。

2.2 黄豆酱理化指标测定

黄豆酱理化指标测定见表2。

表2 黄豆酱理化指标检测结果Table 2 Physical and chemical indexes test results of soybean paste

由表2可知，所制作豆酱符合国家标准GB/T 24399—2009。

2.3 ACE抑制肽液相测定标准曲线

图2 马尿酸标品液相色谱图与标准曲线Fig.2 The HPLC and standard curve of hippuric acid

由图2可知，马尿酸的RT=6.472 min，峰面积与马尿酸浓度曲线拟合相关系数R2=1.0，说明该保留时间处的峰面积能够反映马尿酸的浓度大小。

2.4 超滤结果

将对硫酸铵沉淀、透析后的混合多肽进行超滤，依次分别使用30，10，3 k超滤膜进行超滤。超滤后，将混合多肽分子量分为4段：>30 k，30～10 k，10～3 k，<3 k。多肽含量和ACE抑制活性见图3。

图3 不同分子量区间的多肽含量与ACE抑制率Fig.3 The polypeptide content and ACE inhibitory rates of different molecular weight intervals

由图3可知，10 k以上组分的多肽含量相对较多，但ACE抑制活性随着分子量的增大逐渐减小，各组分ACE抑制率分别为22.8%，57.2%，98.2%，78.88%。经超滤分级去除了部分没有 ACE抑制活性的长肽段，使 ACE 抑制肽主要富集在10 k以下分子量区间，3～10 k分子量的ACE抑制率最大，3 k以下组分的ACE抑制活性也在75%以上，从本结果来看，具有ACE抑制活性的多肽主要为短肽和中短肽，并非水解度越高，ACE抑制活性也越高。这与文献[8-11]报道的ACE抑制肽主要集中在3 k以下的组分有差别，这有待于进一步的研究。将收集的3～10 k分子量组分继续进行DEAE琼脂糖微球交换柱的分离。

2.5 DEAE高流速琼脂糖微球a离子交换柱

图4 3～10k组分的离子交换色谱图Fig.4 Ion exchange chromatogram of 3～10 k components

由图4可知，多肽3～10 k组分上样量20 mL后，分别使用0.1～0.8 mol/L的氯化钠进行洗脱，流速为1.0 mL/min, 1号峰为0.1 mol/L氯化钠洗脱，最大吸光值为0.25，是3～10 k混合多肽中的最大组分，ACE抑制率也是最高的(见图5)。组分IV采用0.5 mol/L的氯化钠洗脱后，组分的ACE活性也达到16.8%。但由于组分洗脱后未经过浓缩，所以ACE抑制率都相对较低。但可以确定，采用0.1 mol/L氯化钠洗脱组分I具有相对较高的ACE抑制活性，并对组分I进行下一步的凝胶柱分离。

图5 离子交换柱洗脱组分的ACE抑制活性Fig.5 ACE inhibitory activity of ion exchange column elution components

2.6 Sephadex G-75 凝胶柱分离纯化

图6 组分DI的凝胶色谱图Fig.6 The gel chromatogram of DI components

由图6可知，组分DI经过G-75凝胶层析后，获得4个峰。对收集的各组分进行ACE抑制活性测定。见图7。组分DGIII的ACE抑制活性是最高的，抑制率为13.62%/40 μL。并对组分DGIII进行冻干浓缩后，ACE抑制活性为(98.3±1.24)%，IC50为0.08 mg/mL。

图7 凝胶色谱分离各组分的ACE抑制活性Fig.7 The ACE inhibitory activity of each component separated by gel chromatography

3 结论与展望

以大豆为底物，采用微生物发酵法制备中国传统黄豆酱，经过研磨、提取获得具有ACE抑制活性的多肽，通过超滤发现，分子量区间3～10 k的多肽ACE活性抑制率最高；并对其组分依次进行了DEAE琼脂糖微球a的柱层析和Sephadex G-75 凝胶柱分离，从而获得了组分DGIII为纯化后的ACE抑制肽，进行浓缩冻干后，测得ACE活性抑制率为(98.3±1.24)%，IC50为0.08 mg/mL，高于文献报道的ACE抑制率[12-14]。现有的文献都已证实ACE抑制肽为一类小分子量多肽，但繁琐的分离纯化步骤耗时耗力，成本较高。但如果能够直接食用，则比较简单。由此来看，开发具有降压作用的食品，黄豆酱无疑是最好的产品，需要注意的是黄豆酱中的食盐一般都比较高，也是为了保证产品质量，避免黄豆酱变质。因而开发具有降压作用的黄豆酱应降低食盐含量，既可以减少NaCl对生物活性物质的抑制作用，还可以方便群众增加摄食的需求。