ABCB1、CYP2C19、CES1基因多态性与缺血性脑卒中患者氯吡格雷抵抗及疗效的关系

刘亚巍 赵小朗 姚璞 程林 孙凤军 曹秋婷

氯吡格雷是目前世界范围内使用最广泛的噻吩并吡啶类抗血小板药，主要用于急性缺血性脑卒中等循环障碍疾病的二级预防。氯吡格雷是一种前体药物，其在小肠的吸收受到编码P-糖蛋白的三磷酸腺苷结合盒转运体超家族B1(ATP binding cassette transporter B1，ABCB1)基因的调控，进入肝脏后约85%经羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CES1)调控代谢转化为无活性代谢产物排出体外，仅15%在细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系作用下分两步代谢转化为活性代谢产物发挥抗血小板作用。相关研究表明亚洲人群中约20%～65%的患者在接受常规剂量的氯吡格雷治疗后不能达到抑制血小板聚集的作用，从而导致心脑血管不良事件的发生，这一现象被称为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)[1]。CR确切的发生机制目前仍不十分清楚，已有文献报道CR的影响因素众多，包括年龄、烟酒史、高血压、糖尿病、药物间相互作用、用药依从性、基因多态性等，其中与药物代谢相关的基因多态性与CR发生的相关性研究受到越来越多关注。

根据2010年美国FDA黑框警告及相关指南[2]推荐，若CYP450酶系中的CYP2C19 基因突变为功能缺陷型(lose-of-function，LOF)时需加大剂量或者换用药物进行治疗，不同代谢表型及基因型的个体应采用不同的用药方案。随着临床应用氯吡格雷越来越广泛，基因多态性与CR及临床终点事件的关系日渐成为研究热点。本研究旨在探讨与氯吡格雷体内代谢密切相关的ABCB1、CYP2C19、CES1基因多态性与缺血性脑卒中患者发生CR及其预后的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象选择2016年10月至2017年12月期间确诊的缺血性脑卒中并服用氯吡格雷治疗的患者90例，其中男68例(75.6%)、女22例(24.4%)，年龄42～75岁，平均(62.8±9.5)岁，BMI值17.3～31.8，平均24.17±3.2。纳入标准：(1)年龄18～75岁，符合全国第四届脑血管学术会议通过制定的脑卒中患者诊断标准[3]，并经脑部CT检查明确诊断为缺血性脑卒中的患者；(2)有能力依从研究方案；(3)无其他严重疾病；(4)所有研究方案均经医院伦理委员会审查批准，且受试者自愿参加研究并签署知情同意书。排除标准：(1)对氯吡格雷过敏或不能耐受者；(2)半年内有内脏出血性疾病病史者；(3)严重肝脏疾患和(或)凝血功能异常者、具有抗血小板治疗禁忌证或近期拟行外科手术者；(4)患瓣膜病、心肌病、心肌炎、先心病、周围血管病、感染性心内膜炎者；(5)晚期肾功能不全、肿瘤及慢性心力衰竭等严重影响近期预后的疾病者。

1.2 仪器与试剂流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)；全自动核酸提取仪〔珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司〕；Nanodrop全波长分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司)；TDZ4-WS台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；焦磷酸测序由凯杰生物技术(上海)有限公司完成。多甲藻素-叶绿素蛋白标记的抗血小板GPⅢa的单克隆抗体(CD61PerCP；美国Becton-Dickinson公司)；1%(体积分数)多聚甲醛(PFA；美国Sigma公司)；0.2 mmol/L的二磷酸腺苷(ADP；美国Biopool公司)；PCR buffer、Taq酶、dNTP、5×Q-Solution〔(凯杰生物技术(上海)有限公司〕；PCR扩增仪(Bio-Rad公司)；核酸提取试剂盒(适用于200 μL人全血样本；上海浩源生物有限公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1实验方案与血样采集：患者在接受至少3 d的双重抗血小板治疗(氯吡格雷75 mg/d，阿司匹林100 mg/d)后进行血小板聚集率测定。

由专业的护士分别抽取氯吡格雷给药前及给药后4 h的静脉血4 mL，弃去前2 mL，后2 mL加入到枸橼酸钠抗凝管中充分混匀，将混匀的抗凝管以500 r/min(相对离心力×35 g)离心3 min，取上清液，得到富含血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，为避免血小板体外活化，标本采集后2 h内完成血小板聚集率的测定。使用正常未活化的样品作为质量控制以检测和控制血小板的活化状态。

目前对于CR尚无公认的一致性标准。不同研究采用的定义大都是经验性的[4-5]。本研究中，用ADP(20 μmol/L)诱导血小板聚集，给予氯吡格雷后的聚集率与未服用药物的聚集率基线值比较，该聚集率差值作为血小板抑制率。将血小板抑制率小于30%，定义为氯吡格雷反应不全；血小板抑制率≥30%，定义为氯吡格雷反应良好。

流式细胞术测定血小板聚集率：分别取未加ADP活化及加20 μmol/L ADP活化的PRP标本5 μL，加入10 μL CD61PerCP轻轻混匀，常温避光染色15 min后加入1 mL冷(2～8℃)固定液以1%(体积分数)PFA充分混匀，置4℃下固定30 min，之后采用流式细胞术检测血小板聚集率。以未加ADP标本为血小板零聚集对照，ADP活化标本中单个血小板数量减少显示血小板聚集率大小。

1.3.2CES1、ABCB1、CYP2C19基因型测定：(1)全血基因组DNA提取：抽取静脉血2 mL，置EDTA抗凝管中充分混匀，于-20℃保存。取200 μL EDTA抗凝血，按全血DNA提取试剂盒的操作方法进行基因组DNA的提取，采用Nanodrop全波长分光光度计测定DNA浓度后稀释制成浓度50 ng/μL的DNA模板，DNA模板置于-20℃保存。

(2)CES1、ABCB1、CYP2C19基因片段扩增：采用PCR方法分别进行目的片段扩增，目标位点包括ABCB1 C3435T、CES1 A816C、CYP2C19*2及CYP2C19*3，引物序列见表1。

表1 各检测单核苷酸多态性位点的引物序列

PCR总反应体积20 μL，包括 10×PCR buffer 2 μL，dNTP mix(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP 等成分，浓度均为1 mmol/L)4 μL，5×Q-Solution 4 μL，上下游引物各 0.2 μmol/L×2 μL，50 ng DNA模板，2.5 U Taq酶，加水补充至20 μL。PCR扩增条件：(1)94℃预变性5 min；(2)94℃变性30 s，60℃复性30 s，72℃延伸1 min，共计35个循环；(3)72℃延伸10 min；(4)4℃条件下保存。

(3)焦磷酸测序：采用PyroMark Q96 MD型仪器进行扩增产物焦磷酸测序以获基因多态性分型结果。

1.3.3用药剂量调整：根据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[6]推荐，根据血小板抑制率及基因多态性结果调整患者的用药剂量。本研究针对血小板抑制率低且携带CYP2C19功能缺陷型基因的患者进行氯吡格雷的治疗剂量调整。若仅有一个等位基因发生突变(LOF1)，建议增加氯吡格雷用量至150 mg/d；若两个等位基因均发生突变(LOF2)，则建议增大用量至300 mg/d，若仍反应不良，则建议将氯吡格雷替换为替格瑞洛。

1.3.4随访：分别在缺血性脑卒中患者接受治疗后的第3、6、12个月进行随访，随访内容包括主要终点事件和次要终点事件。

本研究中主要终点事件包括缺血事件和出血事件。根据《高危非致残性缺血性脑血管事件诊疗指南》[7]，将缺血性事件采用临床检查分为两大类：(1)有症状的缺血并发症，如氯吡格雷治疗期间新出现的短暂性缺血发作或永久性缺血梗死；(2)临床无明显症状的急性血栓栓塞现象。出血事件定义为患者接受氯吡格雷治疗后CT检查发现的颅内出血或颅外出血，停止治疗后出血状况消失。

次要终点采用改良Rankin量表(mRS)评估患者接受治疗后第3、6、12个月的临床表现，本研究采用电话访问或门诊面谈的方式，mRS评分≤2认定为临床效果良好，mRS评分>2认定为临床效果不佳。随访失访率>20%则认为该随访无统计学意义。

1.4 统计学处理采用SPSS 18.0软件进行分析。计量资料若符合正态分布，用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本资料t检验；若不符合正态分布，用四分位数进行统计描述，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料用例数(率)〔n(%)〕表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板抑制率氯吡格雷反应良好52例，反应不全38例。两组血小板聚集情况及血小板抑制率见表2。

表2 患者氯吡格雷反应情况(%)

2.2 基因分型两组患者一般资料及临床资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具体见表3。采用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因分型试剂对90例患者的ABCB1、CYP2C19及CES1基因型分型，分型结果如表4。结果显示，反应不全组与反应良好组的ABCB1 C3435T、CES1 A816C基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)；反应不全组与反应良好组的CYP2C19*2及CYP2C19*3基因型分布比较，差异具有统计学意义(P<0.001)，结果见表5。

表3 不同治疗反应患者一般资料及临床资料比较

表4 患者CES1、ABCB1、CYP2C19等位基因及基因型的分布

表5 反应良好组与反应不全组基因型分布比较〔n(%)〕

2.3 随访结果根据患者临床表现、血小板抑制率及基因型检测结果，本研究针对9例氯吡格雷反应不良患者调整用药方案，其中5例LOF2患者换用替格瑞洛90 mg/d，4例LOF1患者增加氯吡格雷用量至150 mg/d。调整治疗方案的患者临床效果良好，血小板抑制率为(30.1±6.8)%。随访结果显示，随访3、6、12个月时分别有2例(2.2%)、3例(3.3%)、8例(8.9%)患者由于迁居或更换电话而失访，失访率为14.4%(13例)。最终参与统计的随访患者共计77例，其中有13例(16.9%)患者发生缺血事件，4例(5.2%)患者发生出血事件，59例(76.6%)患者的Rankin评分≤2。

结果显示，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CES1 A816C野生型与突变型比较治疗后缺血事件、预后良好情况差异无统计学意义(P>0.05)，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2和 CYP2C19*3野生型与突变型比较治疗后出血事件差异无统计学意义(P>0.05)，而CES1 A816C野生型与突变型比较治疗后出血事件差异有统计学意义，突变型基因更易引起治疗后出血事件的发生(P<0.05)，具体见表6。

表6 基因多态性与治疗后情况比较

3 讨论

本研究旨在探讨ABCB1、CYP2C19、CES1基因多态性与缺血性脑卒中患者发生CR的关联性。

CYP2C19是将无活性的氯吡格雷代谢为活性代谢物的主要代谢酶，其具有多种等位基因突变类型[2]。CYP2C19基因目前共发现35个等位基因，CYP2C19*1为野生型等位基因，CYP2C19*2或CYP2C19*3等多种常见于亚洲人群的等位基因突变可降低酶活性甚至引起酶活性丧失，称为功能缺失型突变。在中国人群中CYP2C19基因突变的类型主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3，这两类等位基因占到了CYP2C19突变的90%～99%，因此本研究中只纳入了CYP2C19*2、CYP2C19*3多态性的检测，结果显示CYP2C19 突变基因频率为50.0%，与文献[8]中南方汉族人中的突变频率(48.45%)相当。

目前，有关ABCB1基因C3435T多态性的研究较多，但该位点突变与氯吡格雷低反应之间的关联性仍存在争议。现有资料显示中国汉族人群中，ABCB1 3435T位点频率达35.38%[9]，因此本研究中选择ABCB1 3435T多态性进行检测，结果显示ABCB1 3435T频率为43.9%，大于文献报道频率。

有研究表明CES1酶常见突变位点包括G143E、D260fs和A816C[10]，上述位点突变均引起CES1酶水解活性显著降低。现有研究显示，G143E、D260fs在亚洲人群的突变率为0%，816C在中国人群的突变频率达23.8%[11]，因此本研究选择816C突变位点进行研究，结果显示本研究中CES1 816C频率为31.7%，亦大于文献报道。综上，除CYP2C19外，本研究中ABCB1 C3435T及CES1 A816C的突变频率均比现有研究资料所示结果高，这可能与患者所处地域以及纳入的样本量有关。

阿司匹林通过抑制血小板环氧化酶-1，阻断花生四烯酸生成血栓烷A2；氯吡格雷通过特异性干扰ADP介导血小板的活化，两者通过不同的途径降低血小板的聚集率从而发挥抗血小板聚集的作用。在一项纳入230例缺血性脑卒中患者的临床研究中，阿司匹林抵抗(asiprin resistance，AR)发生率为1.2%，CR发生率为24.8%[12]，CR发生率远高于AR。一项前瞻性临床体外血小板研究中，与单独使用阿司匹林100 mg相比，使用双抗(氯吡格雷75 mg+阿司匹林100 mg)或单独使用氯吡格雷75 mg治疗的患者经不同ADP浓度诱导的血小板聚集率均显著降低(P<0.05)，且双抗与单独使用氯吡格雷者抑制程度相似。分别接受不同剂量阿司匹林(100 mg、300 mg)与氯吡格雷(75 mg)联合治疗7 d，经ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义(P>0.05)[13]。综上所述，AR在缺血性脑卒中人群中发生率较低，常规剂量阿司匹林血小板聚集抑制率个体差异性较小，且阿司匹林不影响经ADP诱导途径的血小板聚集率，因此本研究主要关注氯吡格雷与经ADP诱导的血小板聚集抑制率之间的联系。

本研究结果表明患者出现氯吡格雷反应良好与反应不全者性别、年龄、BMI、烟酒史、高血压史、糖尿病史、血脂异常、心肌梗死及是否合并用PPI等情况均差异无统计学意义(P>0.05)，与文献[14]报道一致。氯吡格雷反应良好与反应不全者ABCB1 C3435T、CES1 A816C位点的突变患者比例差异无统计学意义(P>0.05)，而CYP2C19*2和CYP2C19*3位点突变患者比例差异有统计学意义(P<0.01)，提示CYP2C19*2和CYP2C19*3位点的突变可能影响药物的药代动力学，甚至影响治疗效果。本研究中根据临床表现、血小板抑制率及基因多态性调整了9例患者的临床治疗方案，结果显示调整用药后患者临床表现改善。一项多中心研究结果表明根据血小板抑制率情况调整治疗方案对临床终点事件并没有改善，所以是否采用常规的CYP2C19基因多态性或血小板抑制率调整治疗方案仍存在争议。因此，建议综合临床表现、血小板抑制率及CYP2C19基因多态性情况来指导临床的个体化用药方案。

本研究随访12个月，总失访率为14.4%。本研究中主要对氯吡格雷治疗后的缺血事件及出血事件观察研究。随访结果显示ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CES1 A816C位点不同基因型治疗后缺血事件、临床转归情况差异无统计学意义(P>0.05)；ABCB1 C3435T、CYP2C19*2和CYP2C19*3位点不同基因型治疗后缺血事件差异无统计学意义(P>0.05)，而CES1 A816C位点不同基因型治疗后缺血事件差异有统计学意义(P<0.05)。有研究显示CES1 A816C通过对非活性代谢物浓度的影响而显著影响氯吡格雷抗血小板活性[10]，本研究结果与文献结论相一致。

综上，本研究显示，氯吡格雷对缺血性脑卒中疗效较好。氯吡格雷治疗缺血性脑卒中过程中，CYP2C19*2及CYP2C19*3基因型可能对血小板抑制率有影响，CES1 A816C基因可能对临床出血事件有影响。阿司匹林及氯吡格雷均可影响患者的缺血事件及出血事件，可能与用药剂量和患者基本情况有关，在后续研究中，可对单用这两种药物患者的缺血事件及出血事件发生情况进行观察，以便临床治疗缺血性脑卒中时更好的选择血小板抑制药物。