自身反应性CD8+中心记忆性T细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎致病作用

杨亭亭 姜红 向雅娟 何洋 刘喷飓 殷贺 高旭光 刘广志

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)的炎性脱髓鞘疾病[1]，多发生于中青年，主要表现为肢体运动、感觉障碍和视力下降等症状。约85%的MS患者以复发-缓解的形式发病，疾病初期恢复较完全，随后逐渐出现不可逆的神经功能缺损而造成终生重度残疾。因此，明确MS的早期发病机制，尽早采取针对性治疗对于控制疾病的进展至关重要。

目前认为，MS的病因主要与T细胞所介导的针对CNS髓鞘的免疫应答有关。以往认为CD4+T细胞(尤其是Ⅰ型辅助性T细胞，typeⅠ helper T cell，Th1)在MS的发病机制中起着关键作用，现今更多研究从遗传学、病理学和免疫学方面证实了CD8+T细胞的重要性[2-5]。据报道，将源自MS患者髓鞘抗原〔包括髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55和蛋白脂蛋白(proteolipid protein，PLP)〕特异性CD8+T细胞过继转移至人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-A2或-A3转基因小鼠体内时，可诱导出类似于MS的早期病理改变[6-7]，提示自身反应性CD8+T细胞在MS早期发病中的重要致病效应。

以往研究发现，根据趋化性细胞因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)的表达，可将记忆性T细胞(包括CD4+T细胞及CD8+T细胞)分为中心记忆性T细胞(central memory T cells，TCM；即CCR7+CD45RA-)、效应记忆性T细胞(effector memory T cells，TEM；即CCR7-CD45RA-)两个亚群；对于CD8+T细胞尚可进一步转化为终末效应记忆性T细胞(terminal effector memory T cells，Ter TEM；CCR7-CD45RA+)亚群[8]。在生理状态下，初始T细胞接触抗原或白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-7和IL-15等细胞因子后分化为TCM，在血流、组织结构和淋巴器官之间循环执行免疫监视功能，在机体再次接触抗原时于相应组织内经抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)刺激后分化为TEM，参与组织结构(包括CNS)内的炎性应答[9]。其中CD8+TEM亚群表达向炎性组织迁移的受体(如CCR5、CXCR3等)，能迅速产生细胞毒性效应，包括穿孔素、颗粒酶-B、干扰素(interferon，IFN)-γ和死亡因子(factor associated suicide，Fas)等介导的途径，但增殖活性较低，最终多数转化为Ter TEM；而CD8+TCM亚群则表达归巢受体(如CD62L)，增殖活性较高，但较TEM细胞毒性功能的产生速度相对缓慢。与上述TCM发现结果相一致，数项研究发现源自同源性TCM(而不是TEM)的抗原特异性CD8+T细胞克隆在猕猴或小鼠体内可长期存活，能够重获记忆性T细胞的表型和功能特性，并在记忆性T细胞库中占据优势[10-12]。这些研究结果提示，CD8+TCM可能在炎性疾病(如MS)的发生和维持过程中较TEM具有更强的免疫活性和存活能力。

作者团队的前期研究发现，与健康对照比较，复发-缓解型MS患者外周血CD8+TCM显著增多，而表达颗粒酶-B和穿孔素的CD8+TEM则显著减少且与临床评分(Kurtzke量表)呈负相关，经免疫调节治疗后CD8+TCM呈减少趋势[13-14]，提示自身反应性CD8+TCM在MS发病过程中，尤其是早期具有重要作用。因此，本研究通过过继转移自身反应性CD8+TCM至Rag-1-/-小鼠，观察对MOG35-55诱导的EAE早期病情及病理改变的影响程度，以探讨该细胞亚群对MS的致病效应及其作用机制验证CD8+TCM的致病效应，期望可以为临床MS早期开展针对性治疗积累资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：6～10周龄、体质量17～20 g雌性C57 BL/6(B6)小鼠，由北京维通利华责任有限公司提供，用于诱导EAE模型获取CD8+T细胞。6～10周龄、体质量17～20 g雌性Rag-1-/-基因敲除小鼠(B6.129S7-Rag1 tmiMom/J)自美国Jackson实验室购得。

1.1.2主要试剂及仪器：鼠源性MOG35-55肽段(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，北京赛百盛公司)，变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)纯度>97%，与完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA；其中含结核分枝杆菌4 mg/mL，美国Sigma公司)1︰1混合后反复抽打制备成乳化液(肽段浓度300μg/mL)。百日咳毒素(pertussis toxin，PTX；美国Enzo life science公司)。小鼠CD8+T细胞阴性选择磁珠试剂盒(德国Miltenyi公司)。细胞示踪剂(Cell TrackerTMGreen BODIPY® dyes)及小鼠多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(peridinin chlorophylla protein，PerCP)标记的CD8单克隆抗体〔美国Becton Dickinson(BD)公司〕；别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的CCR7抗体及其同型对照Rat IgG2a κ Isotype Control；异硫氰酸(fluorescence isothiocyanate，FITC)标记的CD44抗体及其同型对照Rat IgG2b Isotype Control(美国eBbioscienc公司)。主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ H-2Db-MOG35-55四聚体(MHC Ⅰ H-2Db-VGWYRSPFSRVVHL，PE标记，广州雅怡公司)。淋巴细胞分离液(瑞典GE公司)。

细胞培养箱(德国Heraeus公司)，磁珠分选磁力架(德国Miltenyi公司)，FACS Calibur流式细胞仪、流式细胞分选仪(美国BD公司)，异氟烷气体麻醉机(上海任谊生物科技有限公司)，Lecia组织脱水机、Lecia包埋机、Lecia组织切片机、Lecia荧光显微镜(德国)。北大医学部试验技术中心完成分选。

1.2 方法

1.2.1动物分组、EAE模型的建立及TCM分选：(1)动物分组、EAE模型的建立：C57 BL/6小鼠分为EAE组(n=50)及对照组(n=10)。EAE组小鼠按照文献[15]的方法，于脊柱旁两侧4点(腋窝和脊髓腰膨大平面)皮下注射MOG35-55/CFA乳化液100 μL(含MOG35-55肽段300 μg)/只。免疫后0 h(注射乳化液当时)、48 h给予小鼠腹腔注射PTX 200 μL(400 ng)/只。对照组小鼠用等体积NS乳化液替代，同法注射PTX。

自免疫诱导当日始测量小鼠的体质量，并采用双盲法通过Kono 5分法自诱导当日开始每日进行神经功能评分[15-16]。具体评分标准：0分，无临床表现；1分，精神委靡，尾部无力；2分，行走步态异常，双后肢无力；3分，双后肢瘫痪；4分，双后肢瘫痪伴一侧或者两侧前肢瘫痪；5分，濒死或者死亡。1分<评分<5分者考虑建模成功，进入下一步实验。

(2)CD8+T细胞的分离：于EAE小鼠发病高峰期3 d后将其处死，在超净工作台内器械分离取其淋巴结和脾脏，经过70 μm细胞筛碾磨，利用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法获得单个核细胞(mononuclear cells，MNC)，经小鼠CD8+T细胞阴性选择免疫磁珠试剂盒分选CD8+T细胞，部分细胞加入CD8-PerCP抗体，经FACS Calibur流式细胞仪检测CD8+T细胞比例，如所获得CD8+T细胞纯度达90%以上，提示分选纯度高，台盼蓝染色计算细胞活率>95%，提示细胞活性好。可用于进一步的分选及细胞过继转移。健康鼠CD8+T细胞取自同周龄的B6鼠，方法同EAE鼠CD8+T细胞的分离。

(3)CD8+TCM分选：用小鼠CD8-PerCP、CCR7-APC和 CD44-FITC抗体标记经免疫磁珠分选后的EAE鼠CD8+T细胞(>1.0×107/100 μL)，孵育30 min后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗细胞，利用同型对照设门，经流式细胞术分选(图4)获得CD8+CCR7+CD44high细胞群(即CD8+TCM，在CD8+T细胞中比例为4.3%～24.9%)及CD8+CCR7-CD44low细胞群(即CD8+Ter TEM，在CD8+T细胞中比例为2.8%～20.4%)，行台盼蓝染色，镜下观察细胞活率>90%，则提示分选后的细胞仍具有较好的活性，可用于进一步的过继转移。

1.2.2EAE鼠CD8+T细胞及不同亚群进行致病性研究：(1)CD8+T细胞及不同亚群的过继转移及其致病性评估：①CD8+T细胞：将分离的CD8+T细胞重悬于PBS中(1×107/mL)，经鼠尾静脉注射至Rag-1-/-小鼠中(2×106/只)，按CD8+T细胞不同来源分为EAE鼠CD8+T细胞组(n=6)和健康鼠CD8+T细胞组(n=6)。

②CD8+TCM：将Rag-1-/-小鼠分为4组：CD8+TCM常规剂量组(n=6)、Ter TEM组(n=6)、PBS对照组(n=6)及CD8+TCM高剂量组(n=3)。将分选的TCM(常规剂量组2.5×106/mL，高剂量组7.5×106/mL)、Ter TEM(2.5×106/mL)分别重悬于PBS中，经鼠尾静脉注射至Rag-1-/-小鼠中，每只200 μL；PBS对照组注射PBS 200 μL。

注射当日予以100 μL(300 μg)MOG35-55/CFA乳化液背部4点皮下注射，并于免疫当日及48 h后予以PTX 200 μL(400 ng)/(次·只)腹腔注射，操作同1.2.1(1)。自免疫诱导当天起开始测量小鼠的体质量，并采用双盲Kono 五分法[15-16]进行神经功能评分，评分标准同前。观察40 d后全部处死观察病理学改变。

③病理学检测：小鼠麻醉后经左心耳予以冰生理盐水灌注，随后4%多聚甲醛灌注，分离脑组织和腰段脊髓，脑组织冠状位纹状体部位切片取材，轴位切取脊髓腰膨大段，经Leica全自动组织脱水机脱水，石蜡包埋，切片机制作切片，厚5μm，行HE、LFB染色，，每只鼠每种染色取冠状位纹状体、腰膨大各三个不同层面)，于光学显微镜下观察其炎性浸润、髓鞘脱失等病理学改变，炎性浸润(0-4分)和脱髓鞘(0-3分)参照炎性细胞浸润的部位、炎性细胞数目及脱髓鞘程度确定[17]。

(2)CD8+TCM体外刺激的抗原特异性检测及体内示踪：① CD8+TCM体外刺激的抗原特异性检测：分选后CD8+TCM加入IL-2(20 U/mL)培养基中，与经钴(30 Gray)预照射的MNC(1×105/孔)作为APC共培养，每3 d换培养液1次，6 d后加入MOG35-55肽段(终浓度20 μg/mL)做进一步刺激，继续培养3 d收获细胞。加入PE-MHC Ⅰ H-2Db-VGWYRSPFSRVVHL四聚体进行标记，经流式细胞术检测CD8+TCM体外培养前、后表达MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55的细胞比例(即经流式细胞术检测PE通道阳性细胞比例)，以评估CD8+TCM体外培养后的抗原反应性，如比例增加提示抗原反应性增强。

②CD8+TCM的体内示踪：用10 μmol/L细胞示踪剂工作液标记CD8+TCM并重悬于200 μL PBS中，经尾静脉注射至Rag-1-/-小鼠体内(n=2，5×105细胞/只)。为评价细胞是否通过血脑屏障进入CNS，24 h后处死小鼠，取其脾脏、脑、脊髓行冰冻切片，利用Lecia荧光显微镜10倍、20倍镜观察组织内绿色荧光表达的示踪细胞。

2 结果

2.1 EAE发病、神经功能评分及TCM分选

2.1.1EAE的发病、神经功能评分：EAE组于免疫后第13～20 d〔平均(16.4±1.6)d〕陆续出现尾部肌张力减低、下垂等发病表现，后进展为后肢无力、行走不稳；第17～25 d〔平均(21.4±2.4 d)〕症状达高峰，Kono神经功能评分为3.3±0.6分(图1)，此时小鼠体质量较免疫当天下降〔(17.4±1.4)g 比(19.4±0.8)g，P<0.01〕，高峰期持续4～12 d，发病率100%。对照组无发病。

注：EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎，图4～6同

2.1.2CD8+T细胞的分离：于免疫后第25～40 d处死小鼠，取其淋巴结和脾脏获得MNC，分离CD8+T细胞。所获得CD8+T细胞纯度达90%以上(图2)，台盼蓝染色计算细胞活率>95%，可用于进一步的分选及细胞过继。

注：R1：单个核细胞；R2：CD8+ T细胞；Forward Scatter：前向散射光；Side Scatter：侧向散射光；PerCP：多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，图3、图9同

(3)TCM的分选：经流式细胞术分选(图3)获得CD8+TCM，行台盼蓝染色显示细胞活率>90%，可用于进一步的过继转移。

注：FSC(Forward Scatter)-A：前向散射光-面积；SSC(Side Scatter)-A：侧向散射光-面积。APC：别藻蓝蛋白；FITC：异硫氰酸。P1、P2、P3和P4区域分别为淋巴细胞、CD8+T细胞、CD8+ TCM(CD8+CCR7+CD44high)和CD8+Ter TEM(CD8+CCR7-CD44low)

2.2 CD8+T细胞及其亚群的致病性研究

2.2.1CD8+T细胞及其亚群的过继转移：(1)CD8+T细胞过继转移可诱导EAE发病：EAE鼠CD8+T细胞组第27～29 d后出现双后肢瘫痪症状，第32～34 d高峰期Kono神经功能评分均为3分，体质量呈下降趋势；健康鼠CD8+T细胞组均未发病，体质量亦未明显变化(图4)。

图4 CD8+ T细胞过继转移至Rag-1-/-小鼠后神经功能评分

(2)CD8+TCM过继转移未能诱导EAE：CD8+TCM常规剂量组、Ter TEM组、PBS对照组及CD8+TCM高剂量组经连续观察40 d，均未出现尾部无力、肢体瘫痪等症状，且体质量均呈增长趋势。

(3)病理学表现：①EAE组病理学改变：EAE组小鼠脑和脊髓切片HE染色可见大量炎性细胞浸润，LFB染色可见脱髓鞘改变。对照组小鼠则均未发病，病理学未见相关改变(图5)。

图5 两组小鼠脑和脊髓病理表现：HE染色显示：对照组脑组织和脊髓(腰段)内未见明显炎性细胞浸润，脑组织和脊髓(腰段)内可见炎性细胞浸润(图中红色箭头所示)。LFB染色显示，对照组脑纹状体及脊髓(腰段)内未见明显脱髓鞘改变，EAE组小鼠脑纹状体和脊髓(腰段)内可见广泛脱髓鞘改变(图中黄色箭头所示)

②EAE鼠CD8+T细胞组及健康鼠CD8+T细胞组病理学改变：EAE鼠CD8+T细胞组脑和脊髓切片HE染色可见大量炎性细胞浸润，LFB染色可见脱髓鞘改变。健康鼠CD8+T细胞组则未见相关改变(图6)。

注：对照组：健康鼠CD8+ T细胞组；EAE组：EAE鼠CD8+ T细胞组

③ CD8+TCM过继转移后病理学表现：CD8+TCM常规剂量组、Ter TEM组、PBS对照组及CD8+TCM高剂量组小鼠的脑实质和腰段脊髓HE染色均未见炎性细胞浸润(图7)，LFB染色亦未见及脱髓鞘改变(图8)。

图7 各组小鼠脑和脊髓病理表现(HE染色)：各组小鼠脑实质和腰段脊髓HE染色未见炎性细胞浸润

图8 各组小鼠脑和脊髓病理表现(LFB染色)：各组小鼠脑实质和腰段脊髓LFB染色未见脱髓鞘改变。

2.2.2CD8+TCM呈现抗原反应性且通过血脑屏障：(1)CD8+TCM的体外培养后抗原反应性增强：EAE鼠CD8+T细胞经流式分选获取CD8+TCM，利用四聚体MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55检测抗原特异性T细胞，比例为1.2%。另将部分CD8+TCM进行体外培养，经IL-2和MOG35-55刺激后，经同法检测，所得比例为5.06%(图9)。

注：MHCⅠ H-2Db/MOG35-55PE：主要组织相容性抗原Ⅰ H-2Db-MOG35-55四聚体

(2)CD8+TCM可通过血脑屏障：示踪细胞注射后，脾脏中可见大量荧光细胞，而脑和脊髓中可见少量荧光细胞(图10)。

图10 示踪细胞注射后组织中CD8+ T细胞荧光表现：脾脏(A)可见大量荧光细胞，脑组织(B)和脊髓(C)中可见少量荧光细胞(图中红色箭头所示)

3 讨论

MS现是一种主要由CD4+T细胞介导的CNS自身免疫性疾病，其中Th1/Th2、Th17/调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)比例失调被证实构成了MS发病机制的病理生理学基础。但更多的研究[2-5]亦发现CD8+T细胞在MS发病机制中发挥着重要作用。以往Sun等[18]报道体外培养EAE来源CD8+T细胞并予以MOG35-55抗原二次刺激，可形成MOG35-55特异性CD8+T细胞，将该细胞过继转移至B6或Rag-1-/-小鼠中(2×106/只)均可造成小鼠瘫痪发病。与之相一致，在本研究中将EAE鼠来源CD8+T细胞过继转移至Rag-1-/-小鼠体内，同时经皮下注射予以MOG35-55/CFA二次抗原刺激，可在第27～29 d出现后肢瘫痪症状，病理学检测可见脑组织和脊髓内明显的炎性细胞浸润及脱髓鞘改变，再次表明CD8+T细胞具有EAE致病效应。然而，目前尚无研究明确CD8+TCM亚群是否也具有致病效应，故本研究通过将CD8+TCM过继转移进行了初探。

以往研究显示MS患者病情复发或恶化时外周血中记忆性T细胞比例较缓解期明显增加[19]。利用MOG35-55/CFA诱导B6小鼠所建立的EAE模型，在免疫后第10天脾脏中淋巴细胞主要为效应性T细胞，而在1～3个月后则主要为记忆性T细胞[20]。因此，为获取足量CD8+TCM，本研究选择EAE小鼠发病高峰期后(即免疫后第25～40天，而非免疫后第10天)取其脾脏和淋巴结获得CD8+TCM。

为鉴定CD8+TCM的抗原特异性，本研究将其在体外用MOG35-55肽段刺激后通过四聚体技术检测了MOG35-55表达阳性的CD8+T细胞克隆比例。以往研究报道，获取MOG35-55诱导EAE小鼠淋巴结中T细胞(CD8+和CD4+)后，予以MOG35-55和IL-2再刺激，经二聚体(MOG35-55-H-2Db)技术检测阳性细胞比例是20%～60%[18]。本研究显示，CD8+TCM经体外培养后MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55表达阳性的CD8+T克隆比例为5.06%，较刺激前明显增高，表明部分CD8+TCM经MOG35-55肽段刺激后可分化为抗原特异性T细胞，从而在二次抗原刺激时可参与免疫应答反应。此外，目前尚无CD8+TCM体外培养经MOG35-55刺激后抗原特异性CD8+T细胞克隆比例的报道，故本发现无疑为今后的相关研究提供了有益的参考。为明确静脉注射后CD8+TCM能否进入CNS内，本研究采用荧光示踪剂对其进行标记及示踪。正常情况下，少量TCM可进入CNS内执行免疫监视功能[21]。在病理状态下，T细胞的CNS浸润过程被发现由2个时相构成[22-23]：(1)在过继转移后数小时内，少量T细胞即进入CNS内，现认为此类细胞穿过血脑屏障后被APC识别，释放炎性因子IFN-γ、IL-2，形成初次免疫应答；(2)该免疫应答促使3 d后大量T细胞再次进入CNS，进而引起临床发病。在本研究中，我们过继转移示踪剂标记CD8+TCM细胞至Rag-1-/-小鼠中，24 h后在脾脏中可见大量绿色荧光细胞，在脑和脊髓内可见及少量荧光细胞浸润，与既往研究结果类似[22-24]，这表明CD8+TCM经静脉注射后进至CNS内，可能进一步诱导或促进了CNS免疫应答。

在本研究中，自身反应性CD8+T细胞过继转移(2×106/只)可致病，而将自身反应性CD8+TCM、CD8+Ter TEM过继转移至Rag-1-/-小鼠(5×105/只)体内，观察40 d未见发病症状，脑和脊髓的病理学检测亦未显示CNS内的炎性细胞浸润或髓鞘脱失。据此，以上结果表明CD8+T细胞具有EAE致病效应，而CD8+TCM则明显缺乏此类效应。对于CD8+TCM过继转移细胞量(5×105/只)的选择主要基于如下两方面依据：一方面，根据本研究结果显示，CD8+TCM亚群在CD8+T细胞中比例为4.3%～24.9%，而CD8+Ter TEM则为2.8%～20.4%。鉴于过继转移2×106EAE鼠来源CD8+T细胞至每只Rag-1-/-小鼠即可诱发EAE，而CD8+TCM、CD8+Ter TEM亚群在CD8+T细胞中比例均低于25%，故可认为0.5×105(即2×106×25%)的过继转移细胞量足以满足本研究的要求。另一方面，目前已有研究证实，过继转移抗原特异性CD8+T细胞(5x105/只)至B6或Rag-1-/-小鼠即可引起小鼠瘫痪[18]。综上，本研究将过继转移的细胞(CD8+TCM和CD8+Ter TEM)数量定为5×105/只。Elyaman等[20]研究发现，将EAE鼠来源CD4+记忆性T细胞经尾静脉注射过继转移至TCRαβ-/-小鼠体内〔(1～1.5)×106/只〕可明显其引起瘫痪发病。鉴于本研究中以5×105/只CD8+TCM数量过继转移至Rag-1-/-小鼠(n=6)均未发病，为排除因细胞量不足影响本实验结果的可能性，另设一更大剂量CD8+TCM过继转移组(n=3)，其细胞量达1.5×106/只，同样观察40 d亦未见小鼠发病此，因细胞量不足而导致实验结果阴性的可能性不大，进一步支持本研究的结论。

以往针对MS患者的研究(人体研究)中，CD8+TCM在MS患者中显著增多，经免疫调节治疗后显著减少。但在本研究中，动物实验结果未发现被动转移CD8+TCM能够诱导EAE的发生。对此矛盾结果，分析原因，一方面可能是动物与人体自身免疫应答差异较大，另一方面可能是本文作者团队前期人体研究仅为初步研究，其样本量不大且没有进一步的亚组研究(如缓解期、复发期相关研究)等诸多不足，今后可进一步深入研究(如扩大人体研究的样本量、分组研究及机制研究，动物实验中其他记忆性CD8+T细胞亚群等)探讨。

此外，本研究中CD8+TCM过继转移未曾发病，分析其原因有以下两种可能性：(1)以往Sun等[18]发现将同源性细胞过继转移至B6小鼠第7～8天后即可发病，而将B6来源MOG特异性T细胞过继转移至Rag-1-/-鼠后，其发病时间延迟至数周或数月不等。本研究在CD8+TCM过继转移后观察时间持续40 d未发病，可能存在受体小鼠延迟发病的可能性；(2)Ifergan等[25]报道纯化的TEM较非TEM更易穿透血脑屏障内皮细胞，且血脑屏障内皮选择性募集了TEM，据此推测CD8+TCM的致病作用可能主要是维持CNS内的慢性炎性状态，并非之前所述的诱导MS相关的免疫应答，而TEM则可能在诱导对CNS免疫应答的过程中起着更为重要的作用。对此，尚需今后延长对TCM过继转移后的观察时间或围绕TEM亚群进行研究求证。

总之，本研究显示，虽然EAE自身反应性CD8+T细胞的过继转移可诱导Rag-1-/-小鼠发病，但自身反应性CD8+TCM的过继转移则未能诱导出EAE病症及其相应的病理学改变，表明该TCM亚群缺乏明显的EAE致病效应，究其原因可能是该细胞群在疾病发病过程中主要参与了对CNS内慢性炎症的维持，而非对MS相关之免疫应答的诱导。由于本研究存在观察周期宜更长、无TEM组以及未观察过继转移后CNS的炎性状态等局限性，故对TCM及其相关亚群(如TEM)在EAE中的确切作用，仍需今后进一步的研究予以明确。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突