白藜芦醇抑制ox-LDL活化血小板TLR2和MMP1表达的分子机制

陈会莲 薛芸 孙杰 张晟皓 王慧 陈北冬 齐若梅

脑血管病是全球高致死、高致残和高复发的疾病，动脉粥样硬化是脑血管疾病的重要病理基础[1]。研究结果显示，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)可损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的发生与进展[2]；刺激血小板活化，促进血栓形成。目前，通过抑制血小板功能途径预防脑血管疾病已成为重要的防治策略。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系统的受体家族，能对病原相关分子模式和危险相关分子模式做出免疫应答[3]，参与动脉粥样硬化的发生与进展[4-5]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是细胞外含有锌离子的蛋白水解酶，可通过蛋白质水解使血管细胞外基质胶原成分降解，与不稳定型斑块相关联[6-7]。MMPs大多由内皮细胞、平滑肌细胞和炎症细胞产生，但血小板活化是否产生MMPs尚不清楚。白藜芦醇(resveratrol，RSV)是一种植物多酚，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等作用[8-10]。该研究探讨了RSV对ox-LDL刺激血小板TLR2和MMP1表达的影响及相关的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料血液源自健康献血者，每位捐赠者均签署书面知情同意书。实验操作符合《赫尔辛基宣言》有关原则。本研究经北京老年医学研究院伦理委员会批准通过(No.201606)。

1.2 主要试剂RSV购自美国Sigma-Aldrich公司(Lot# SLBS1063V)，抗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)抗体、抗TLR2抗体、抗MMP1抗体购自Abcam公司，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、兔抗山羊二抗购自北京中杉金桥公司，环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA试剂盒购自Abcam公司，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和一氧化氮(nitric oxide，NO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，红色线粒体超氧化物荧光探针MitiSOXTM购自Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1制备洗涤血小板：采集健康献血者血液，置枸橼酸抗凝真空采血管。以200 g离心10 min，分离上清，获到富血小板血浆。加入TYRODE Buffer(含138 mmol/L NaCl、3.3 mmol/L NaH2PO4、2.9 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5.5 mmol/L Glucose、20 mmol/L HEPES，pH 7.2)和 9∶1的ACD，添加2 mmol/L EDTA，混匀，以200 g离心10 min。弃上清，悬浮细胞。再次离心，获得洗涤血小板。

1.3.2制备ox-LDL：收集血清，采用梯度超速离心法分离低密度脂蛋白。使用5 μmol/L硫酸铜氧化，37℃，10 h，加入1 mmol/L EDTA终止反应。随后采用PBS(pH 7.3)4℃透析24 h，4℃储存。

1.3.3分组及处理：将纯化的血小板分为对照组、ox-LDL处理组及RSV 1、10、100 μmol/L干预组。对照组和ox-LDL处理组分别用配置RSV溶液的溶剂孵育10 min，干预组分别用1、10和100 μmol/L RSV孵育10 min。然后，除对照组外各组分别加入ox-LDL(0.1 mg/mL)刺激血小板10 min，终止反应。根据作者既往研究结果显示ox-LDL处理10 min可诱导血小板炎症蛋白表达[11]，该研究采用ox-LDL处理10 min后检测血小板MDA、SOD、cGMP和NO水平。

1.3.4MDA、SOD、cGMP和NO水平检测：按照试剂盒说明书步骤检测血小板MDA、SOD、cGMP和NO水平。每个实验重复4次。

1.3.5Western blot方法检测TLR2、MMP1和NOX4蛋白表达：对照组和ox-LDL处理组分别用配制RSV溶液的溶剂孵育10 min，干预组分别用1、10和100 μmol/L RSV孵育血小板10 min，然后，除对照组外各组分别加入ox-LDL(0.1 mg/mL)刺激血小板10 min，终止反应。检测TLR2表达时，增加了LPS(5 μg/mL)刺激血小板的实验。将血小板分为对照组、LPS处理组及RSV 1、10、100 μmol/L干预组。对照组和LPS处理组分别用配制RSV溶液的溶剂孵育10 min，干预组分别用1、10和100 μmol/L RSV孵育10 min。除对照组外各组分别加入LPS(5 μg/mL)刺激10 min，终止反应。每个实验重复4次。将样本进行SDS-PAGE电泳后，转膜、脱脂奶粉封闭2 h。使用TLR2、MMP1和NOX4特异性抗体孵育4℃过夜。TBS-T洗3次。二抗(1∶10000)孵育2 h。使用ECL发光液发光，用凝胶成像仪成像，采用ImageJ 软件分析蛋白条带灰度与内参条带灰度比值表示蛋白相对表达水平。

1.3.6血小板线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)测定：将20 μg/mL鼠尾胶原蛋白包被载玻片过夜。以RSV(100 μmol/L)孵育血小板10 min，加入0.1 mg/mL ox-LDL 10 min，以350 g离心10 min，用含MitiSOXTM(1∶2000)的Tyrode’s/HEPES缓冲液重悬(1×106)血小板，取血小板重悬液加于载玻片上反应30 min。吸除多余的血小板悬液，用缓冲液洗涤3次。在共聚焦显微镜下观察荧光强度，60倍镜下成像，对各组荧光强度进行定性分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 25.0软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；两均数比较用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血小板TLR2表达比较与对照组比较，ox-LDL处理组血小板TLR2蛋白表达明显增加(t=0.021，P<0.01)；ox-LDL处理组及不同浓度RSV干预组间比较TLR2蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F=2.240，P<0.01)，与ox-LDL处理组比较，RSV 100 μmol/L干预组TLR2表达降低(P<0.05)。与对照组比较，LPS处理组血小板TLR2表达明显增加(t=0.004，P<0.01)；LPS处理组及不同浓度RSV干预组间比较TLR2蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F=2.279，P<0.05)，与LPS处理组比较，RSV 100 μmol/L干预组血小板TLR2表达降低(P<0.05)。结果见图1。

注：ox-LDL：氧化低密度脂蛋白，RSV：白藜芦醇，图2～6同；LPS：脂多糖；TLR2：Toll样受体2；A：ox-LDL刺激实验；B：LPS刺激实验；aP<0.05，bP<0.01

2.2 各组血小板MMP1表达比较与对照组比较，ox-LDL处理组血小板MMP1表达增加(t=0.009，P<0.01)。ox-LDL处理组及不同浓度RSV干预组间血小板MMP1表达比较有统计学差异(F=6.160，P<0.01)，与ox-LDL处理组比较，RSV 100 μmol/L干预组MMP1表达降低(P<0.01)。结果见图2。

注：MMP1：基质金属蛋白酶1；aP<0.01

2.3 各组血小板NOX4表达与对照组比较，ox-LDL处理组血小板NOX4表达增加(t=0.002，P<0.01)。ox-LDL处理组及不同浓度RSV干预组间血小板NOX4表达比较差异有统计学意义(F=7.886，P<0.01)，与ox-LDL处理组比较，RSV 100 μmol/L干预组NOX4表达降低(P<0.01)。结果见图3。

注：NOX4：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4；aP<0.01；bP<0.05

2.4 各组血小板线粒体ROS水平与对照组比较，经ox-LDL处理可增加血小板线粒体ROS水平，而RSV(100 μmol/L)可降低其水平。结果见图4。

2.5 各组血小板MDA和SOD水平与对照组比较，ox-LDL处理组血小板MDA水平升高(t=0.001，P<0.01)。ox-LDL处理组及不同浓度RSV干预组间血小板MDA水平比较差异有统计学意义(F=30.654，P<0.01)，与ox-LDL处理组比较，RSV1、10、100 μmol/L干预组血小板MDA水平降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组比较，ox-LDL处理组血小板SOD活力降低(t=0.040，P<0.05)。ox-LDL处理组及不同浓度RSV干预组间血小板SOD活性比较差异有统计学意义(F=3.276，P<0.05)，与ox-LDL处理组比较，RSV 100 μmol/L干预组SOD活性升高(P<0.05)。结果见图5。

注：MDA：丙二醛，SOD：超氧化物歧化酶；aP<0.01；bP<0.05

2.6 各组血小板NO/cGMP水平与对照组比较，ox-LDL处理组血小板NO水平降低(t=0.004，P<0.01)；ox-LDL组及不同浓度RSV干预组间血小板NO水平比较差异有统计学意义(F=29.343，P<0.01)，与ox-LDL组比较，RSV 1、10、100 μmol/L干预组血小板NO水平增加(均P<0.01)。与对照组比较，ox-LDL处理组cGMP水平降低(t=0.002，P<0.01)；ox-LDL组及不同浓度RSV干预组间血小板cGMP水平比较差异有统计学意义(F=13.043，P<0.01)，与ox-LDL处理组比较，RSV 10、100 μmol/L干预组cGMP水平升高(均P<0.01)。结果见图6。

3 讨论

动脉粥样硬化是一种血管的慢性炎症性疾病，是心脑血管疾病的病理基础[12]。血小板作为炎症细胞通过分泌各种炎症蛋白、P-选择素、血小板因子4和激活后调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTENS)等细胞因子募集炎症细胞到内皮细胞损伤部位，促进血管炎症，参与动脉粥样硬化的发生与进展[13]。血小板表达多种TLRs受体，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR8和TLR9[3，14]。既往研究表明，TLR2可介导血小板活化，参与血小板黏附、释放和聚集[15]。ox-LDL是动脉粥样硬化发生的危险因素[16]，血循环中ox-LDL增加不仅损伤内皮细胞，还能刺激血小板活化。MMPs具有消化血管基质成分的作用，病理条件下MMPs水平增加会导致血管结构紊乱。因此，减少血管炎症以及降低MMPs水平对于延缓动脉粥样硬化病变进展具有重要意义。

近年来作者团队研究显示，RSV能够抑制血小板TLR4表达，并能够增加血小板沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表达和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)磷酸化[11]。然而，RSV对ox-LDL刺激血小板活化MMPs的影响尚不清楚。该研究结果显示，ox-LDL可刺激血小板TLR2和MMP1表达，RSV能抑制这一炎症反应。NO/cGMP为细胞内第二信使，具有抑制血小板功能的作用。该研究结果显示RSV能够逆转活化血小板NO/cGMP降低的变化，提示RSV不仅能抑制ox-LDL刺激活化血小板炎症蛋白表达，同时还能增加细胞内保护性分子水平。此外，该研究亦发现RSV可抑制ox-LDL刺激血小板NOX4表达以及ROS产生，进一步证实RSV抑制血小板功能的分子机制与减少线粒体氧化损伤相关。

综上所述，本研究显示，RSV能够通过降低血小板TLR2、MMP1和 NOX4的表达，减少血小板ROS和MDA的产生，并增加NO/cGMP含量，提示RSV具有抑制ox-LDL刺激血小板活化的作用，其分子机制与抑制氧化损伤和增加细胞内保护性分子NO/cGMP水平有关，表明RSV通过多个分子靶点抑制血小板功能，可能成为抑制动脉粥样硬化血管炎症干预的潜在药物。