彭君 彭家清 秦鹏 罗先荣 张敏 (荆州市中心医院肾内科,湖北 荆州 434020)
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,长期的代谢紊乱及高血糖状态易引起心血管、肾、神经系统等损害及功能障碍,导致糖尿病肾病(DN)等并发症〔1〕。DN是糖尿病最常见的微血管并发症,其致病机制涉及活性氧(ROS)的产生、晚期糖基化终末产物(AGE)的积累及蛋白激酶(PK)C等细胞内信号分子的活化等,但其具体机制仍未详细阐明〔2〕。DN是导致终末期肾脏病的主要原因,其主要危险因素包括高血糖、高血压和遗传易感性,根据其病理特征和演变过程可将其分为5期,早期DN采用阻断多元醇通路、抑制炎症递质产生和蛋白激酶C通路及晚期糖基化或非糖基化等治疗方法可逆转肾脏损害,延缓病理进程;而Ⅳ期或Ⅴ期,肾功能将持续性减退甚至衰竭〔3,4〕。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为18~22 nt的内源性非编码RNA分子,通过与靶mRNA 3′非编码区特异性结合可调节基因表达,参与细胞生长、分化、胚胎发育、免疫应答等生物过程〔5〕。已有研究〔6〕表明,miR-133b,miR-342和miR-30a在2型DN患者尿液中高表达,其表达水平与收缩压-舒张压、低密度脂蛋白、肾小球滤过率等有关,可作为2型DN的生物标志物。而miR-214已被证实在糖尿病小鼠肾皮质中表达上调,抑制miR-214可减弱肾小球肥大及系膜扩张〔7〕。本研究就miR-214-5p表达水平对高糖诱导的HMC细胞炎症反应及纤维化的影响进行研究。
1.1材料 HMC细胞(批号:4200)购自美国Science Cell公司;胎牛血清(批号:SH41288)、RPMI1640培养液(批号:SH30807)购自美国Gibco-BRL公司;D-葡萄糖(批号:MB2510)购自大连美仑生物科技公司;Lipofectamine 2000转染试剂(批号:11668027)购自美国Invitrogen公司;Trizol试剂(批号:15596)、RIPA裂解液(批号:R0020)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(批号:BSP0161)、电化学发光(ECL)液(批号:PE0030)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:D0010)购自北京Solarbio公司;对照(control)小干扰RNA(siRNA)、同源盒蛋白(HOXA)13 siRNA由山东维真生物科技有限公司设计合成;HOXA13过表达载体(pcDNA-HOXA13)由金瑞斯生物科技公司构建;TaKaRa反转录试剂盒(批号:RR047A)、TaKaRa实时荧光定量试剂盒(批号:RR820A)购自宝生物工程(大连)有限公司;miR-214-5p荧光定量引物购自TaqMan公司;control抑制剂(inhibitors)、miR-214-5p inhibitors、control模拟物(mimics)、miR-214-5p mimics由上海吉玛公司设计合成;兔抗HOXA13(批号:ab106503)、细胞间黏附分子(ICAM)-1(批号:ab53013)、骨形态发生蛋白(BMP)7(批号:ab27569)、纤维连接蛋白(FN)(批号:ab2413)、β-肌动蛋白(β-actin)(批号:ab8227)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(批号:ab6721)购自英国Abcam公司;Forma TM Steri-cycle TM i160 CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司;Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪购自上海创萌生物科技有限公司;CFX96 Touch TM荧光定量PCR检测系统、ChemiDoc TM MP凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2细胞培养与分组 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养HMC细胞,每天更换新鲜培养液。取对数生长期的细胞,胰酶消化后重悬,以6×103个/孔接种于96孔板,待细胞生长至汇合度约45%,按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书分别将control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、control mimics、miR-214-5p mimics、pcDNA空载体、pcDNA-HOXA13、miR-214-5p inhibitors和control siRNA、miR-214-5p inhibitors和HOXA13 siRNA转染至HMC细胞;将细胞分为NG组、HG组、Control组、anti-miR-con组、anti-miR-214-5p组、HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-214-5p组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA-HOXA13组、HG干预(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)组。
处理方法:NG组(含5 mmol/L D-葡萄糖的培养液培养48 h);HG组(含30 mmol/L D-葡萄糖的培养液培养48 h);Control组(常规培养);anti-miR-con组(转染control inhibitors);anti-miR-214-5p组(转染miR-214-5p inhibitors);HG+anti-miR-con组(转染control inhibitors后以30 mmol/L D-葡萄糖处理48 h);HG+anti-miR-214-5p组(转染miR-214-5p inhibitors后30 mmol/L D-葡萄糖处理48 h)、HG+pcDNA组(转染pcDNA后30 mmol/L D-葡萄糖处理48 h);HG+pcDNA-HOXA13组(转染pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖处理48 h);HG干预(anti-miR-con、anti-miR-214-5p、anti-miR-214-5p+pcDNA、anti-miR-214-5p+pcDNA-HOXA13)组(分别转染control inhibitors、miR-214-5p inhibitors、miR-214-5p inhibitors+pcDNA、miR-214-5p inhibitors+pcDNA-HOXA13后30 mmol/L D-葡萄糖48 h)。
1.3RT-qPCR 收集NG组、HG组、Control组、anti-miR-con组和anti-miR-214-5p组细胞,充分研磨,Trizol法提取总RNA,微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系,以β-actin为内参进行PCR扩增,每个样品重复3次。采用F=2-△△Ct法分析miR-214-5p相对表达量。β-actin引物:上游:5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,下游:5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。
1.4Western印迹 各组细胞中加入RIPA裂解液,置于冰上裂解细胞,4℃,12 000 r/min离心20 min,收集上清。将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入兔抗HOXA13(1∶500)、ICAM-1(1∶2 000)、BMP7(1∶500)、FN(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗体4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,每次10 min;加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育2 h,TBST洗涤;ECL发光显影,每个蛋白样品重复3次。
1.5双荧光素酶报告基因实验 取HMC细胞,按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别将HOXA13 3′UTR野生型质粒或突变型质粒分别与control mimics、miR-214-5p mimics、control inhibitors和miR-214-5p inhibitors共转染,培养48 h后加入裂解液裂解。4℃,12 000 r/min离心10 min,取上清,检测荧光素酶活性。
1.6统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。
2.1高糖诱导HMC细胞中miR-214-5p表达上调 HG组细胞中miR-214-5p表达水平显著高于NG组(4.67±0.35 vs 1.01±0.10;t=30.164,P<0.001)。
2.2HMC细胞转染miR-214-5p inhibitors的效率检验 Control组miR-214-5p相对表达水平为1.00±0.14;anti-miR-214-5p组细胞中miR-214-5p相对表达水平显著低于anti-miR-con组(0.33±0.08 vs 0.96±0.13;P<0.001)。
2.3下调miR-214-5p表达抑制高糖诱导的HMC细胞炎症反应及纤维化 对比NG组,高糖刺激的HMC细胞中ICAM-1和FN蛋白表达水平显著升高(P<0.05),BMP7蛋白表达水平显著降低(P<0.05);而将miR-214-5p inhibitors转染至HMC细胞进行预处理后,高糖刺激的细胞中ICAM-1和FN蛋白表达水平较HG+anti-miR-con组显著降低(P<0.05),而BMP7蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图1、表1。
1~4:NG组、HG组、HG+anti-miR-con组、HG+anti-miR-214组图1 Western印迹检测ICAM-1、BMP7、FN蛋白表达
表1 下调miR-214-5p表达抑制高糖诱导的HMC细胞炎症反应及纤维化
2.4miR-214-5p靶向调控HOXA13表达 通过Targetscan在线预测发现,HOXA13 3′UTR上存在miR-214-5p的结合位点(图2);miR-214-5p mimics与HOXA13 3′UTR-WT共转染后荧光素酶活性下降(0.35±0.06 vs 1.00±0.11;t=15.563,P<0.001),而与HOXA13 3′UTR-MUT共转染后荧光素酶活性无明显变化(0.99±0.11、0.98±0.07;t=0.230,P=0.821);并且过表达miR-214-5p,HOXA13蛋白表达水平显著降低(0.30±0.06 vs 1.00±0.10,P<0.05),抑制miR-214-5p表达则HOXA13蛋白表达水平显著升高(1.86±0.14 vs 0.98±0.08,P<0.05)。见图3。
图2 miR-214-5p靶向调控HOXA13的表达
1~4:miR-con组、miR-214组、anti-miR-con组、anti-miR-214组图3 Western印迹检测HOXA13蛋白表达
2.5过表达HOXA13抑制高糖诱导的HMC细胞炎症反应及纤维化 与NG组比较,高糖刺激的HMC细胞中ICAM-1和FN蛋白表达水平显著升高(P<0.05),BMP7蛋白表达水平显著降低(P<0.05);而将pcDNA-HOXA13转染至HMC细胞后,高糖刺激的细胞中ICAM-1和FN蛋白表达水平较HG+pcDNA组显著降低(P<0.05),而BMP7蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4和表2。
1~4:NG组、HG组、HG+pcDNA组、HG+pcDNA+HOXA13组图4 Western印迹检测HOXA13、ICAM-1、BMP-7、FN蛋白表达比较
2.6miR-214-5p和HOXA13对高糖干预的HMC细胞TGF-β1信号通路的影响 HG组TGF-β1蛋白表达水平显著高于NG组(3.10±0.30 vs 1.00±0.11,P<0.05);HG+anti-miR-214组TGF-β1蛋白表达水平较HG+anti-miR-con组显著降低(1.30±0.10 vs 3.17±0.28,P<0.05);HG+anti-miR-214+si-HOXA13组TGF-β1蛋白表达水平较HG+anti-miR-214+si-con组显著升高(2.70±0.12 vs 1.40±0.13,P<0.05)。见图5。
1~6:NG组、HG组、anti-miR-con组、anti-miR-214组、anti-miR-214+si-con组、anti-miR-214+si-HOXA13组图5 Western印迹检测TGF-β1蛋白表达
TGF-β1在DN发生发展中起关键作用,可与跨膜受体结合而激活Ⅰ型受体,活化的Ⅰ型受体进一步催化下游信号分子Smads磷酸化,从而诱导下游级联反应〔8〕。TGF-β1可刺激成纤维细胞分泌FN、层黏蛋白等细胞外基质蛋白,同时促进单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞的浸润,诱导上皮间质转化(EMT)〔9〕。BMP-7属于TGF-β超家族,是一种分泌型多功能蛋白,可上调钙黏附蛋白E表达,逆转TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分化,同时抑制上皮细胞凋亡并减少炎性细胞因子释放,从而拮抗TGF-β1的促纤维化作用〔10〕。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族,能够通过与其受体特异性结合增强炎症细胞与内皮细胞间的黏附作用,可促进炎症反应;抑制FN、TGF-β1和ICAM-1蛋白表达可减缓肾纤维化〔11〕。
miRNA在细胞生长代谢过程中起重要作用,其异常表达与多种疾病的发生发展密切相关。据报道〔12,13〕,miRNA能够调控胰岛素分泌,通过调控血管紧张素(Ang)Ⅱ、TGF等抑制肾间质纤维化,缓解肾小球损伤,并抑制炎症反应和足细胞凋亡。研究〔14〕表明,miR-214可通过调节基质金属蛋白酶(MMP)、Ⅰ型胶原表达,抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞纤维化;过表达miR-214能够增强肝细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进肝纤维化形成〔15〕。此外,已有相关研究〔16〕证实,miR-214-5p在肝细胞中异常表达,过表达miR-214-5p可上调MMP-2、α-平滑肌肌动蛋白和TGF-β1等纤维化相关基因表达,促进肝纤维化。本研究以30 mmol/L D-葡萄糖刺激HMC细胞,细胞中miR-214-5p表达上调,ICAM-1和FN蛋白表达水平升高而SMP-7蛋白表达水平降低;抑制miR-214-5p表达则细胞中ICAM-1、FN和SMP-7蛋白表达水平的升高或降低均有所恢复。提示,miR-214-5p对高糖诱导的HMC细胞纤维化具有抑制作用。通过Targetscan在线预测、双荧光素酶报告基因实验及Western印迹验证发现,miR-214-5p可靶向调节HOXA13蛋白表达。
同源盒基因(HOX)基因最早在果蝇被中发现,能够调控组织器官发育并维持其正常生物学功能,在胃肠道、中枢神经系统等组织器官发育中起关键调节作用〔17〕。HOXA13在胃癌、胶质瘤等病灶组织中异常表达,其表达水平与病情分级和预后密切相关,能够通过调节磷酸化Smad蛋白表达及TGF-β信号传导途径促进细胞侵袭及EMT〔18,19〕。而在高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞中,HOXA13和BMP-7蛋白表达水平显著降低,通过上调HOXA13表达可抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT的发生〔20〕。此外,彭力等〔21〕采用脂质体转染技术在人肾小管上皮细胞中上调HOXA13表达发现,BMP-7表达上调,高糖诱导的EMT受到抑制。本文将pcDNA-HOXA13转染至HMC细胞后,ICAM-1和FN蛋白表达显著受到抑制;SMP-7蛋白表达水平升高,这一结果与文献〔21〕一致。而采用RNAi技术沉默HOXA13表达可逆转下调miR-214-5p对TGF-β1蛋白表达的抑制作用。
综上所述,高糖可刺激HMC细胞中miR-214-5p高表达,通过抑制miR-214-5p可靶向负调控HOXA13表达,从而激活TGF-β1通路,发挥抗炎和抗纤维化作用;提示,miR-214-5p可能成为糖尿病肾病的生物标志物,并且miR-214-5p和HOXA13有望成为DN治疗的新靶点。