葛根素通过下调miR-196a-3p促进大鼠成骨细胞增殖和分化的机制

王海珍 王丽娟 贠云飞

(1唐山市协和医院中医科，河北 唐山 063000；2唐山市迁西县人民医院骨科)

骨质疏松是一组以骨量减少、骨微结构退化为主要特点的代谢性骨病变，患者多伴有腰背痛且骨脆性增加极易发生骨折，严重影响患者生活质量〔1〕。成骨细胞是调节骨形成和骨重建过程的重要功能性细胞，能特异性分泌多种生物活性物质，促进骨基质形成和骨组织矿化，是预防和治疗骨质疏松的重要靶点〔2，3〕。葛根素是从中药葛根中提取的单体成分，具有雌激素样作用，对成骨细胞增殖和分化具有促进作用〔4，5〕。但目前葛根素促进成骨细胞增殖、分化的具体机制还不清楚。miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，通过调节靶基因转录后表达影响多种生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等〔6〕。相关研究报道〔7〕，miR-196a-3p能够调控骨质疏松易感基因的单核苷酸多态性(SNP)功能位点，与骨矿物质密度有关，提示miR-196a-3p可能在骨质疏松发病中发挥潜在作用。本研究以大鼠成骨细胞CP-R091为研究对象，观察miR-196a-3p和不同浓度葛根素对成骨细胞增殖和分化的影响，并探讨葛根素影响miR-196a-3p表达促进大鼠成骨细胞增殖和分化的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株和主要试剂 大鼠成骨细胞CP-R091(武汉普诺赛生命科技有限公司)；葛根素(中国药品生物制品检定所，纯度96.0%)；胎牛血清(HyClone公司)；DMEM培养液(Gibco公司)；LipofectamineTM 2000转染试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末(Sigma公司)；二甲基亚砜(Sigma公司)；TRIzol试剂(北京天根生化科技有限公司)；SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒(Roche公司)；RIPA裂解液(北京天根生化科技有限公司)；骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、成骨特异性转录因子(Runx2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体及二抗(北京奥维亚生物技术有限公司)；miR-196a-3p模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)、Runx2过表达和抑制表达载体均由广州锐博生物科技有限公司设计合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染 CP-R091细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，培养箱温度37℃，CO2质量分数5%，培养至细胞达80%～90%融合时，用胰酶消化细胞进行传代培养。

取对数生长期的CP-R091细胞，以2×105个/孔接种于6孔板中培养，当细胞达50%～70%融合时，使用LipofectamineTM2000转染试剂分别将miRNA-inhibitor阴性对照、miR-196a-3p-inhibitor、miRNA-mimics阴性对照、miR-196a-3p-mimics、pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1-Runx2、小干扰RNA(siRNA)阴性对照、siRNA-Runx2转染至细胞，并分别记为anti-miR-NC组、anti-miR-196a-3p组、miR-NC组、miR-196a-3p组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Runx2组、si-NC组和si-Runx2组，每组设置6个重复孔，转染24 h后检测转染效率。

1.2.2MTT实验检测细胞增殖活性 取未转染的CP-R091细胞以5×103个/孔接种于96孔板，培养箱中培养24 h后，分为葛根素组和对照组。葛根素组分别加入葛根素终浓度0.01 μmol/L、0.10 μmol/L、1.00 μmol/L，对照组加入等体积DMEM完全培养液，继续培养，分别于加药后第0、1、3、5天，每孔加入新鲜配制的5 mg/ml的MTT溶液20 μl培养4 h，倒掉孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150 μl反应10～15 min。酶标仪检测每孔490 nm波长处吸光度(A)值。转染组细胞增殖活性检测同上。

1.2.3RT-qPCR检测miR-196a-3p表达 收集生长状态良好的各组细胞，加入TRIzol试剂抽提总RNA，分光光度计测定RNA样品浓度和纯度，使用Takara逆转录酶将RNA逆转录合成cDNA，以U6为内参基因使用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒进行qPCR。miR-196a-3p上游引物序列：5′-GGAACGGCAACAAGAAACTG-3′，下游引物序列：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，于上海生工生物工程有限公司合成。qPCR反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火60 s，共35个循环。结果采用2-△△Ct法计算miR-196a-3p相对表达量。

1.2.4Western印迹检测细胞分化相关蛋白及Runx2蛋白表达 使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白样品浓度，将蛋白样品放入100℃水浴中变性3 min，取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，电泳结束后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用封闭液封膜1 h。加入稀释的OPN、ALP、Runx2、GAPDH抗体4℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化酶标记二抗室温孵育2 h。洗膜，加入电化学发光(ECL)溶液显色，紫外凝胶成像系统中曝光，应用Image Pro Plus软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为对照计算目的蛋白相对表达量。

1.2.5双荧光素酶报告基因实验 为验证miR-196a-3p是否靶向Runx2，将Runx2的3′UTR和突变的3′UTR构建荧光素酶报告基因载体，分别与miRNA-mimics阴性对照和miR-196a-3p-mimics共转染大鼠成骨细胞，转染36 h后收获细胞并检测细胞中荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1葛根素对大鼠成骨细胞CP-R091增殖、分化及细胞中miR-196a-3p表达的影响 与对照组比较，培养第3天，葛根素1.00 μmol/L组细胞增殖活性明显升高(P<0.05)，培养第5天，葛根素0.10 μmol/L和1.00 μmol/L组细胞增殖活性均明显升高(P<0.05)；与对照组比较，葛根素0.10 μmol/L和1.00 μmol/L组miR-196a-3p相对表达量明显降低(P<0.05)，OPN、ALP相对表达量明显升高(P<0.05)。见图1、表1。

1～4：对照组、葛根素0.01 μmol/L组、葛根素0.10 μmol/L组、葛根素1.00 μmol/L组图1 葛根素对CP-R091细胞中OPN、ALP表达的影响

2.2抑制miR-196a-3p对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-196a-3p组CP-R091细胞中miR-196a-3p相对表达量明显降低(P<0.05)，培养第3天和第5天时细胞增殖活性明显升高(P<0.05)，细胞中OPN、ALP蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)。见表2、图2。

1：anti-miR-NC组；2：anti-miR-196a-3p组图2 抑制miR-196a-3p对大鼠成骨细胞中OPN、ALP表达的影响

2.3过表达miR-196a-3p能够逆转葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的作用 选用对大鼠成骨细胞增殖促进作用较强的葛根素(1.00 μmol/L)做后续实验。与葛根素+miR-NC组比较，葛根素+miR-196a-3p组CP-R091细胞中miR-196a-3p相对表达量明显升高(P<0.05)，培养第3天和第5天时细胞增殖活性明显降低(P<0.05)，细胞中OPN、ALP蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。见图3、表3。

1：葛根素+miR-NC组；2：葛根素+miR-196a-3p组图3 葛根素对过表达miR-196a-3p的大鼠成骨细胞中OPN、ALP表达的影响

2.4miR-196a-3p靶向Runx2 生物信息学软件mirtarbase(http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)分析结果显示(图4)，miR-196a-3p能够与Runx2的3′UTR区互补结合。双荧光素酶报告基因实验结果，过表达miR-196a-3p明显抑制大鼠成骨细胞中Runx2的活性，而将Runx2的3′UTR区突变后抑制作用消失。见表4。Western印迹结果表明，过表达miR-196a-3p的大鼠成骨细胞中Runx2表达明显降低〔miR-NC组(1.02±0.06) vs miR-196a-3p组(0.36±0.03),P<0.05〕，抑制表达miR-196a-3p的大鼠成骨细胞中Runx2表达明显升高〔anti-miR-NC组(1.01±0.06) vs anti-miR-196a-3p组(1.58±0.08)，P<0.05〕。见图5。

图4 miR-196a-3p能够与Runx2的3′UTR区互补结合

表4 双荧光素酶报告实验

1～4:miR-NC组、miR-196a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-196a-3p组图5 miR-196a-3p靶向调控Runx2

2.5过表达Runx2对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响 与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-Runx2组CP-R091细胞在培养第3天和第5天时细胞增殖活性明显增强(P<0.05)，细胞中OPN、ALP蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图6、表5。

图6 过表达Runx2对大鼠成骨细胞中OPN、ALP表达的影响

2.6抑制Runx2表达能够逆转葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的作用 与葛根素+si-NC组比较，葛根素+si-Runx2组CP-R091细胞在培养第3天和第5天时细胞增殖活性明显降低(P<0.05)，细胞中OPN、ALP蛋白表达明显降低(P<0.05)。见表6、图7。

1：葛根素+si-NC组；2：葛根素+si-Runx2组图7 葛根素对抑制Runx2表达的大鼠成骨细胞中OPN、ALP表达的影响

3 讨 论

雌激素替代疗法是目前治疗绝经后骨质疏松的常用方法，可有效降低骨质疏松的发病率，但资料显示，该方法增加了卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌的发生风险〔8，9〕。因此植物雌激素的使用受到了高度关注。葛根素是中药葛根的有效提取成分，其化学结构与雌激素相似，是一种植物雌激素，多项研究表明，葛根素具有增加骨量、促进成骨细胞生长和功能、改善骨代谢的作用，对防治骨质疏松具有良好疗效〔10～12〕。本研究使用不同浓度葛根素处理大鼠成骨细胞，MTT实验检测细胞增殖活性，并测定成骨细胞分化相关蛋白ALP和OPN的水平，观察葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响，结果表明葛根素能够促进大鼠成骨细胞增殖和分化，其中1.00 μmol/L的葛根素效果最好。

近年来，miRNA在成骨分化中的作用越来越受到重视〔13〕。高杰等〔14〕利用基因芯片技术检测骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中miRNA差异表达情况，结果表明miR-363等7个miRNAs表达上调，miR-192等6个miRNAs表达下调，证实miRNAs参与调控骨髓间充质干细胞向成骨分化。梁兴伦等〔15〕报道，补肾方能通过干预成骨细胞中差异表达的miRNA调控其靶基因进而改善骨质疏松。提示干预骨形成相关miRNA对改善骨质疏松具有重要意义。本研究发现，葛根素处理大鼠成骨细胞后，细胞中miR-196a-3p表达下调，并证实抑制miR-196a-3p表达后成骨细胞增殖和分化能力明显增强。本研究进一步用葛根素处理过表达miR-196a-3p的成骨细胞，结果发现过表达miR-196a-3p后葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的促进作用受到抑制。提示葛根素促进大鼠成骨细胞增殖和分化的作用与下调miR-196a-3p有关。

Runx2是成骨分化特异性转录因子，能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并调控多种成骨标志基因的转录、参与调控骨形态发生蛋白通路、转化生长因子β通路及Wnt通路从而促进骨形成〔16～18〕。张莹莹等〔19〕报道，葛根素能够上调成骨细胞中Runx2的表达，其作用可能与干涉靶向Runx2的miRNA有关。本研究利用生物信息学软件分析发现，miR-196a-3p能与Runx2的3′UTR区特异性结合从而抑制其转录活性，并证实抑制表达miR-196a-3p的大鼠成骨细胞中Runx2表达升高，而过表达Runx2明显促进成骨细胞增殖和分化。为证实Runx2对葛根素促进成骨细胞增殖和分化的影响，本研究用葛根素处理抑制表达Runx2的成骨细胞，结果葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的促进作用受到抑制，说明抑制Runx2逆转了葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的促进作用。因此推测葛根素下调成骨细胞中miR-196a-3p表达，可能通过靶向负调控Runx2的表达，实现促进大鼠成骨细胞增殖和分化的作用。

综上所述，葛根素能够有效促进大鼠成骨细胞体外增殖和分化，并证实葛根素通过下调miR-196a-3p靶向促进Runx2的表达影响成骨细胞增殖和分化。本研究为葛根素在骨质疏松临床防治中的应用提供了实验基础。