上调VEGF-B基因对慢性心力衰竭大鼠的作用及机制

陈磊 吴小燕 (海南医学院第二附属医院心内科，海南 海口 570100)

慢性心力衰竭属于心功能逐渐减退的病理过程，当心力衰竭出现后，心脏会在疾病的作用下导致引起心肌重构，进而导致心功能出现进行性的下降〔1〕。有研究表明〔2〕，慢性心力衰竭的基本病理机制为心肌重构，当心脏结构发生改变后，心肌舒张功能出现障碍，心排血量明显不足，不能满足机体所需要的代谢需求，其临床表现为日常活动受限，伴随着不同程度的呼吸困难，属于多种心血管疾病的终末阶段。血管内皮生长因子(VEGF)-B属于VEGF家族中的成员，具有促血管生成、保护神经、供给机体营养的作用，并参与脂质代谢等生物学过程〔3〕。VEGF-B作为一种促进血管生成因子，具有促进心肌血管新生和促进心肌血管内皮的增殖的作用〔4〕。有研究表明〔5〕，低水平的VEGF-B和心脏疾病中发生心室重构、左心室功能有关。本研究观察上调VEGF-B基因对慢性心力衰竭大鼠作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取SPF级SD健康大鼠40只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，鼠龄(3.9±0.6)个月，体重(225.8±11.5)g。所有大鼠养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间1 w。本研究所做实验均获得医院伦理委员会批准。

主要试剂：Lipofectmine 2000转染试剂盒(购于北京义翘神州科技有限公司)，RPMI 1640培养基(购于武汉纯度生物科技有限公司)，Ca试剂盒、CaN试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)，小鼠抗大鼠NFAT3抗体、兔抗大鼠p-NFAT3抗体(购于Santa cruz公司)。

1.2方法

1.2.1基因转染 取小鼠心肌细胞放置于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清)、恒温为37℃、含有体积分数为5%的CO2的培养箱中进行培养，当培养瓶中细胞融合率达到80%～90%时使用0.25%的胰酶消化，传代。按照Lipofectmine 2000转染试剂盒操作说明书对小鼠心肌细胞进行转染，根据转染物的不同将小鼠心肌细胞分为siRNA-VEGF-B(上调)细胞、siRNA-对照序列细胞。将转染后的小鼠心肌细胞放置于恒温为37℃、含有体积分数为5%的CO2的培养箱中进行培养，进行后续实验。

1.2.2建模及分组 随机选取40只小鼠中的10只作为对照组，另外30只小鼠建立参照Ahemed等〔6〕研究实验中腹腔注射阿霉素的方法建立慢性心力衰竭大鼠模型，将阿霉素配制成2 mg/ml的溶液连续6 w注射于大鼠腹腔(4 mg/kg)，使用10%水合氯醛注射于大鼠腹腔进行麻醉处理，之后使得大鼠仰卧在操作台上，并作固定，剃除大鼠胸前区毛发，测定心脏左心射血分数，当左心射血分数<60%时则表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功。将建模成功的30只慢性心力衰竭大鼠随机分为模型组、上调组、下调组各10只。将转染后的小鼠siRNA-VEGF-B(上调)心肌细胞、siRNA-对照序列(下调)心肌细胞分别注射于上调组、下调组小鼠心肌处，模型组和对照组不做任何处理。

1.2.3样本采集 随机选取各组中的7只大鼠采用断头法处死，立即取大鼠心肌组织，将提取的组织制作标本，使用40 ml/L的多聚甲醛进行固定，常温下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，其中各组中的1份心肌组织样本行病理组织学观察，其中3份心肌组织剪碎放置于器皿中，之后将5 ml 25%的胶原酶Ⅱ加入，将心肌细胞分离出，剩余3份心肌组织样本行后续指标检测。

1.2.4病理组织学观察 取各组中的1份心肌组织样本行病理组织学观察，进行苏木素-伊红(HE)染色处理后使用显微镜观察病理变化。

1.2.5心功能测定 对各组剩余的3只大鼠心功能进行检测，在检测前称量各大鼠体质量，并10%水合氯醛腹腔注射于大鼠腹腔进行麻醉处理(0.004 ml/kg)，仰卧位固定于实验台上。做气管插管，行气管插管并连接小动物呼吸机，将右颈外动脉分离后行结扎处理，结扎所分离出的右颈外动脉远心端，使用动脉夹对大鼠动脉近心端夹闭，并在动脉壁剪以小口，将带有肝素的静脉穿刺套管针逆行刺入，并慢慢将穿刺针退出，缓慢将导管推进左心室，之后将穿刺套管核和压力换能器相连接，将BL-420S生物信号采集和分析系统接入，记录四组大鼠左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVEDP)、左心室内压力上升的最大速率(+dp/dt)、左心室内压力下降的最大速率(-dp/dt)及心率变化。

1.2.6心室重构参数测定 在大鼠完成上述心功能测定后将3 ml 10%氯化钾液注射于静脉中，促使大鼠心脏在舒张末期停止搏动，之后迅速打开大鼠胸腔，将心脏取出，使用冷胜利盐水冲洗，之后将心脏外结缔组织、大血管及心房取出，将右心室沿着室间隔剪去，使用滤纸吸干后对左心室质量(LVAM)进行称取，计算左心室质量指数(LVMI)，LVMI=LVMI/大鼠体重，使用直接测量法计算大鼠左心室短轴、长轴长度，计算球形指数(SI)，SI=左心室长轴长度/左心室短轴长度。

1.2.7心肌细胞中Ca2+浓度检测 将所分离出的心肌细胞放置于温度为37℃水中行水浴处理，之后使用Fluo/AM避光孵育，孵育时间为1 h，之后在转速为3 000 r/min的离心机中离心处理1 min，去除负载液，并使用生理记录液反复洗涤3次。使用激光共聚焦显微镜对形态完成、染色效果较好的细胞进行扫描，心肌细胞中荧光值(钙离子浓度)测定：激发波长为488 nm、发射波长为520 nm。之后使用计算机将图像处理，得到细胞内分布图。最后经过系统分析、换算出心肌细胞中Ca2+浓度。

1.2.8心肌组织中钙调神经磷酸酶(CaN)活性、T细胞活化因子(NFAT)3、磷酸化(p)-NFAT3蛋白检测 使用酶学比色法检测四组大鼠心肌组织中CaN活性，使用Western印迹检测四组大鼠心肌组织中NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组病理组织学观察 如图1所示，对照组大鼠心肌细胞排列整齐、横纵纹较为清晰，细胞核形态、大小正常，心肌细胞间质无纤维细胞增生。模型组大鼠心肌细胞排列混乱，间隙肿胀、增宽，心肌纤维缺损，细胞核呈现为圆形，细胞质不均匀。下调组大鼠心肌细胞排列混乱呈现为波浪状，无横纵纹，细胞核固缩，细胞质不均匀，心肌细胞间质出现炎细胞浸润现象，心肌纤维缺损、断裂。上调组大鼠心肌细胞排列整齐，可见有横纵纹，存在轻度的心肌纤维颗粒状变性，且存在缺损、断裂，细胞核呈现为圆形。

图1 各组大鼠病理组织学观察(HE，×100)

2.2各组大鼠心功能指标变化比较 与对照组相比，模型组、下调组、上调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显降低，LVEDP、心率均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，下调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显降低，LVEDP、心率均升高，上调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显升高，LVEDP、心率均明显降低(均P<0.05)；与下调组大鼠相比，上调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显升高，LVEDP、心率均明显降低(均P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠心室重构情况比较 与对照组相比，模型组、下调组、上调组大鼠LVAM、LVMI均明显增大，SI均明显缩小(P<0.05)；与模型组相比，下调组大鼠LVAM、LVMI明显增大，SI明显缩小，下调组大鼠LVAM、LVMI明显增大，SI明显缩小(均P<0.05)；与下调组相比，上调组大鼠LVAM、LVMI明显缩小，SI明显增大(均P<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白变化比较 与对照组相比，模型组、下调组、上调组大鼠心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，下调组大鼠心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显升高，上调组大鼠心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显降低(均P<0.05)；与下调组相比，上调组大鼠心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显降低(均P<0.05)。见表3、图2。

表2 各组大鼠心室重构情况比较

组别Ca2+浓度(nmol/L)CaN(U/mg蛋白)NFAT3p-NFAT3对照组79.56±5.455.62±0.340.25±0.090.18±0.01模型组149.56±15.261)12.45±2.251)0.89±0.121)0.65±0.051)下调组169.56±20.141)2)15.24±3.121)2)0.96±0.101)2)0.73±0.101)2)上调组100.24±7.621)2)3)7.23±0.981)2)3)0.69±0.011)2)3)0.45±0.091)2)3)F/P值5.735/0.0014.032/0.00112.624/0.0017.747/0.001

图2 Western印迹检测心肌组织中NFAT3、p-NFAT3蛋白

3 讨 论

慢性心力衰竭的发生可导致心功能、心脏结构发生异常，且多数患者均伴随着神经体液变化和血流动力学的改变，最终导致动脉血液灌注不足、静脉淤血等〔7〕。目前随着我国老龄化现象的日益加重，多种心血管疾病的发病率逐渐升高，慢性心力衰竭的发病率随之升高，严重威胁着人类的生命安全，因此防治慢性心力衰竭对降低疾病发病率和死亡率尤为重要〔8〕。

VEGF-B在临床上一直被认为是血管内皮因子家族中的具有多种生物学功能的多条，能对血管外基质讲解、细胞迁移、细胞黏附等具有调节作用，对内皮祖细胞向血管内皮细胞分化、内皮细胞分化成管腔具有调节作用，为血管的再生提供了有利条件〔9，10〕。微血管灌注重要组成部分为心肌血管再生，可促进心脏修复和改善心室重构〔11〕。VEGF-B能够促进心肌血管内皮增殖，对血管再生具有调节作用，可对受损的心肌细胞具有修复作用〔12〕。目前有研究表明，在患有心脏疾病的患者中，其血清中VEGF-B水平显著低于健康人〔13〕。本研究结果提示，上调VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重构，促进大鼠心脏功能的恢复。

慢性心力衰竭的发生与心肌重构的发生有关，有研究表明〔14～16〕，Ca2+-CaN-NFAT3信号通路参与多种原因所导致的心肌重构、心力衰竭、心肌肥大等发展过程，并在上述病理过程中有着重要的意义。心肌重构是慢性心力衰竭发生的病理基础，在其发生发展过程中CaN作为起始信号传导系统，活化T细胞核因子属于CaN作用的下游靶点，而NFAT3属于CaN下游靶点所调控的蛋白，在CaN所介导的心肌重构中具有重要的作用〔17～19〕。Ca2+属于一种细胞内信号传导信使，进而CaN所介导的心肌重构信号通路有关，当心肌细胞中的Ca2+浓度升高后会将CaN激活，促进p-NFAT3失去磷酸化作用，当p-NFAT3去磷酸化后会进入细胞核，诱导多种和换心肌细胞相关基因的异常表达，最终引发心肌重构的发生，最终导致心力衰竭的发生〔20〕。本研究结果说明上调VEGF-B基因可在一定程度上改善慢性心力衰竭大鼠心功能和心室重构，促进大鼠心脏功能的恢复机制可能与上调VEGF-B基因后通过作用于Ca2+-CaN-NFAT3信号通路，降低心肌细胞中Ca2+浓度，使得心肌组织中CaN失活，调控NFAT3、p-NFAT3蛋白表达有关。但目前临床上对于VEGF-B基因与Ca2+-CaN-NFAT3信号通路、慢性心力衰竭之间的联系并无研究，因此本研究结果还需后续实验进一步研究证实。