哮喘大鼠支气管高反应性与气道重塑的相关性

王心晓 欧宗兴 齐见旭 (中南大学湘雅医学院附属海口医院呼吸内科，海南 海口 570208)

哮喘是一种以气道炎症、可逆性气流受限和支气管高反应性为特征的下呼吸道慢性疾病〔1〕。随着哮喘病程的延长，嗜酸粒细胞浸润等因素会引起气道重塑，包括上皮紧密连接缺失、上皮杯状细胞化生、网状基底膜增厚(RBM)和气道平滑肌(ASM)的肥大和增生〔2〕。目前评估哮喘患者病情的方法包括支气管激发试验测定支气管高反应性、肺功能检查及气道炎症指标(嗜酸性粒细胞和一氧化氮等)检测〔3〕。研究虽已表明气道重塑与肺功能下降相关〔4〕，但对于支气管高反应性与气道重塑之间的关系及在哮喘病程中所扮演的角色尚不清楚，为此本研究通过建立哮喘模型大鼠探讨哮喘大鼠支气管对组胺的高反应性与气道重塑和哮喘病程的相关性。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠20只，4～6周龄，体重200～220 g，购自广东省医学实验动物中心，经过适应性喂养后，分成对照组10只和哮喘组10只。

1.2动物建模 哮喘组建模过程参照既往已发表相关文献〔5〕，分为致敏和激发两个阶段。具体为：①致敏阶段，哮喘组大鼠在第1天和第8天，腹腔注射含氢氧化铝(上海源生科技)100 mg，卵蛋白(上海源生科技)100 mg的现配溶液1 ml。②激发阶段：从第15天用1%卵蛋白液雾化吸入刺激，每次时间约30 min，隔天1次，共雾化8 w。当大鼠出现口唇发绀、气促、抽搐、站立不稳等表现时候，表示模型建立成功。对照组大鼠致敏和激发两个阶段均使用生理盐水，方法同模型组。本研究符合动物实验伦理准则，并获得大学动物伦理委员会的许可。

1.3肺功能检查和支气管激发试验 应用小动物肺功能仪(加拿大 SCIREQ公司)测量两组大鼠肺功能情况，记录数值包括第1秒用力肺活量(FEV1)、肺活量(VC)、呼气流量峰值(PEF)和最大呼气中期流量(MMEF)。哮喘组行支气管激发试验测定气道对乙酰胆碱(Ach)和组胺(Hist)的反应性：分别让大鼠吸入0.157、0.316、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000和20.000 mg/ml的氯化乙酰胆碱溶液(上海联硕生物科技有限公司)和0.078、0.157、0.316、0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 mg/ml的磷酸组织胺溶液(上海联硕生物科技有限公司)，每次吸入后，用肺功能仪测量FEV1。通过定量雾化吸入器吸入上述药物，持续时间为1 min，浓度从低到高，直至出现阳性结果。根据吸入的Ach或Hist的对数浓度，绘制出相应曲线，计算FEV1下降百分比。支气管高反应性的定义为吸入激发剂后，FEV1降低20%，PC20即为引起FEV1下降20%的激发剂浓度，分别记录PC20-Ach 和PC20-Hist数值。试验结束时，让大鼠吸入沙丁胺醇气雾剂(上海联硕生物科技有限公司) 200 μg恢复初始气道状态。

1.4标本采集和处理 两组大鼠于末次吸入后的24 h内用1 ml 1%的戊巴比妥进行腹腔注射麻醉，之后从右肺上叶和下叶支气管取2～3个支气管标本。

1.5RBM和ASM厚度的测量 支气管标本在10%甲醛中固定，包埋在石蜡中，切割3 mm，用苏木素-伊红(HE)染色。从2个不同活检标本的5个切片中测定支气管上皮底部到网状层外边界的厚度即为RBM厚度；在至少5个切片中测量穿过细胞核的ASM细胞的直径大小即为ASM厚度。所有厚度的评估全部由图像分析软件Image Pro Plus 5.0完成。

1.6统计学方法 应用SPSS25.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组大鼠支气管组织病理形态学改变 对照组大鼠支气管管壁结构完整，无炎细胞浸润现象；哮喘组大鼠支气管壁可见大量的炎细胞浸润，以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主，支气管管壁结构错乱，气管壁和周围大量炎细胞浸润，气管壁明显增厚，平滑肌肥大，管腔狭窄明显。见图1。

图1 两组支气管病理形态学改变(HE，×100)

2.2两组支气管重塑指标比较 哮喘组RBM厚度〔(8.94±0.68)μm vs (4.02±0.75) μm〕、ASM厚度〔(9.27±0.46)μm vs (4.43±0.54) μm〕和支气管嗜酸性粒细胞浸润数〔(0.69±0.11)个/mm2vs (0.11±0.03)个/mm2〕均显著高于对照组(P<0.05)。

2.3哮喘与肺功能、支气管高反应性和气道重塑的关系 哮喘与ASM呈显著正相关(r=0.48，P<0.05)，与肺功能指标FEV1(r=-0.37)、PEF(r=-0.53)和MMEF(r=-0.35)及支气管激发试验指标PC20-Hist(r=-0.43)呈显著负相关(P<0.05,P<0.001)；但与PC20-Ach(r=-0.28)及RBM(r=0.27)无显著相关性(P>0.05)。

2.4影响ASM厚度的相关因素 ASM厚度与PC20-Hist呈显著负相关(r=-0.39，P<0.01)，但与FEV1(r=-0.15)、PEF(r=-0.20)、MMEF(r=-0.26)和PC20-Ach(r=-0.23)无显著相关性(P>0.05)。

3 讨 论

支气管高反应性是气道对各种刺激因子的反应性异常增强，使得气道过强或过早的收缩致气管扩张效应丧失，是哮喘重要的发病机制之一〔6〕。哮喘患者的气道平滑肌细胞在缩气管刺激减弱时，仍有维持收缩的能力，导致固定性的气流受限。随着哮喘的反复发作和病程的迁延，气道壁会重复损伤和修复这一过程，而气道壁的结构也在此过程中逐渐发生改变即气道重塑，表现为平滑肌细胞的肥大、基底膜的增厚和上皮下纤维化等特征〔7〕。

本研究纳入的哮喘大鼠和对照大鼠比较体现了哮喘的致敏状态和嗜酸性粒细胞浸润的特点。嗜酸性粒细胞作为过敏性炎症反应的特征性细胞，在哮喘的气道重塑和气道炎症中扮演着重要角色〔8〕，一方面嗜酸性粒细胞释放过敏介质，使得气道血管通透性增加，气道分泌物和渗出物增多；另一方面，嗜酸性粒细胞产生转化生长因子β，也诱导气道平滑肌细胞的肥大和杯状细胞的增殖〔9〕。支气管活检结果表明哮喘大鼠发生了明显的气道重塑，引起了平滑肌的增生和基底膜的增厚。ASM和RBM的测定是评价气道是否发生重塑及气道重塑严重程度的关键指标〔10〕，这是因为ASM细胞是支气管内的主要结构细胞，随着哮喘的进展，ASM细胞不断增生肥大，并会分泌和沉积大量的细胞外基质，使得RBM增厚，引起气道壁的不可逆改变。此外，ASM细胞通过表达细胞黏附因子、趋化因子等参与炎症和重塑过程〔11〕。

本研究通过相关性分析显示哮喘病程越长，肺功能越差，这是因为虽然哮喘在早期是可逆的气流受限，但随着病程的迁延和反复，气道壁逐渐发生重塑，肺部结构改变，可逆性的气流受限转化为了固定受限，肺功能也逐渐下降〔12〕。相比RBM，ASM在评估哮喘病程和代表气道重塑方面具有更重要的临床意义。在气道高反应性指标方面，哮喘大鼠对于组胺的刺激相比乙酰胆碱更加敏感，激发试验的成功率也会更高〔13〕。本研究结果提示临床上对于哮喘患者气道反应性的评估，应用组胺作为激发剂敏感性更强，应优先选择组胺进行激发试验；而对哮喘气道重塑的检查与严重程度的评价，ASM应该作为首选指标。这也与国外相关研究结果相一致〔14，15〕，组胺引起的气道高反应性在哮喘的病理生理机制中扮演着关键角色，是引起ASM肥大和气道重塑的直接原因〔16，17〕，而针对组胺信号通路的抑制则可以显著改善气道平滑肌的异常收缩问题，这也为未来哮喘治疗的新靶点提供了方向〔18〕。

综上，哮喘大鼠有显著气道重塑现象，表现为RBM的增厚ASM的肥大；气道重塑与支气管对组胺的高反应性显著相关，且二者是哮喘病程的重要预测因素。