乌头赤石脂丸方对急性心肌梗死大鼠血清炎症因子及心肌CX43蛋白表达的影响

谢璐璐 郭军鹏 张兆鹏 连春雨 肖钰雪 史晓梅 王松 刘宏岩

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠状动脉血流急性受阻、中断导致相应的心肌严重缺血坏死，临床症状危急，死亡率较高，容易引起心力衰竭。据《2018年中国心血管病报告》显示〔1〕，AMI死亡率总体呈上升态势，已经成为我国重大的公共卫生问题。近年来中医药在冠心病的防治上取得了良好的效果，但对AMI的防治还缺乏更加有效、方便、快捷的办法。

中华中医药学会《胸痹心痛中医诊疗指南》中明确指出胸痹心痛相当于西医的冠心病心绞痛〔2〕。课题组前期实验已证实乌头赤石脂丸方可改善心肌缺血损伤的程度，减少心肌细胞的凋亡，并可改善心肌缺血再灌注造成的心肌损伤〔3～5〕。基于课题组已研究的成果，本实验旨在进一步探讨乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心功能的保护作用及AMI与炎症反应的关系。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD雄性大鼠，体重(260±20)g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，本实验通过长春中医药大学实验动物伦理委员会审查批准。

1.2药物 乌头赤石脂丸方依据张仲景《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治第九》中原方原比例而定，乌头选用川乌。方中蜀椒、川乌、干姜、附子、赤石脂比例为 2∶1∶1∶1∶2，中药饮片均购自长春中医药大学附属医院中药饮片房。本实验在不改变药物量效比例的前提下，易丸为汤，根据人服用药量换算成大鼠给药量，大鼠日用量为：蜀椒1.26 g、乌头0.63 g、附子0.63 g、干姜0.63 g、赤石脂1.26 g，中剂量为临床等效剂量，低、高剂量分别按中剂量1/3、3倍比例换算可得。煎煮方法：将川乌放入 10 倍体积水中浸泡 30 min，煎30 min，再与附子同煎 60 min后放入蜀椒、干姜、赤石脂(包煎)文火煎15 min，过滤汤液，后再加8倍体积的水文火煎煮15 min，过滤汤液，将2次煎煮的汤液混匀浓缩备用。

1.3试剂 苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号 G1120)。C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6、脑钠肽(BNP)试剂盒(北京华英生物技术研究所)；心肌缝隙连接蛋白(CX)43蛋白抗体(美国 Proteintech 公司，批号：26980-1-AP)。

1.4仪器 BL-420S 型小动物生物机能实验系统；HX-100E 型小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，CA-600 型全自动凝血分析仪(希森美康医用电子有限公司)，生物显微镜(型号：Motic Panthera i)，奥林巴斯倒置荧光显微镜(型号：Dp80)。

1.5模型制备及分组给药 将SPF级SD雄性大鼠适应性饲养1 w后，随机分成正常组、模型组、乌头赤石脂丸方低、中、高剂量组、尿激酶组，除正常组以外，其余组分别采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备AMI模型。术后第2天开始给药治疗，正常组常规饲养，模型组用等量生理盐水灌胃，乌头赤石脂丸治疗组予乌头赤石脂丸浓缩液，尿激酶组予以尿激酶2.5万U/只腹腔注射。连续给药7 d。

1.6心肌组织HE染色 取下的心肌组织用预冷生理盐水进行清洗干净，放入4%的多聚甲醛溶液中，于近心尖部的位置横行切片，HE 染色，镜检照相。

1.7心肌组织免疫荧光染色 脱蜡和水化，抗原热修复，内源性过氧化物酶灭活，封闭，一抗孵育，二抗孵育封片，荧光显微镜下观察心肌组织CX43蛋白含量表达的情况。

1.8血清指标检测及凝血四项指标的测定 腹主动脉采血6～8 ml，静置30 min，离心机3 500 r/min离心15 min，取上清液，酶联免疫吸附试验检测CRP、IL-6、BNP的含量；按照全自动凝血分析仪的操作流程进行操作，测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(Fbg)。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心电图的影响 与正常组比较，模型组心电图见心肌缺血改变，ST段弓背型显著抬高。与模型组相比较，乌头赤石脂汤各剂量组及尿激酶组心电图均有ST段降低或病理性Q波。见图1。

图1 乌头赤石脂丸方对急性AMI大鼠心电图的影响

2.2乌头赤石脂丸对AMI大鼠CRP、IL-6、BNP的影响 与正常组比较，模型组血清中CRP、IL-6、BNP含量显著增加(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，乌头赤石脂丸低、中、高剂量组血清中CRP、IL-6、BNP含量均显著降低(P<0.01，P<0.05)，尿激酶组CRP、BNP显著降低(P<0.05，P<0.01)，见表1。

2.3乌头赤石脂丸对AMI大鼠凝血四项的影响 与模型组比较，乌头赤石脂丸中、高剂量组PT、TT时间降低(P<0.05，P<0.01)，乌头赤石脂丸低、中、高剂量组APTT时间降低(P<0.01)，Fbg含量减少(P<0.01)，差异均有统计学意义。见表1。

2.4乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心肌组织形态学的影响 正常组可见心肌细胞着色均匀，细胞核位于细胞中央，核大小及形态正常；模型组可见心肌纤维扭曲断裂，肌丝排列疏松紊乱，细胞着色不均匀，部分细胞核固缩，心肌细胞数量减少，且有大量炎性细胞浸润；乌头赤石脂汤低、中、高剂量组及尿激酶组心肌形态均有不同程度的明显改善，其中低剂量组心肌纤维仍有轻度扭曲，排列不整齐，炎性细胞散在分布的情况，中剂量组及高剂量组的心肌纤维排列趋于整齐，炎性细胞浸润减轻，高剂量组心肌损伤改善明显，与尿激酶组趋于相同，见图2 。

图2 乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心肌组织形态学的影响(HE，×400)

2.5乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心肌组织中CX43蛋白含量的影响 正常组心肌大量表达CX43蛋白(0.391±0.031)，表达产物为蓝色荧光，在心肌中分布均匀；模型组CX43蛋白表达(0.304±0.012)明显下降，分布不均匀，心肌纤维扭曲紊乱；乌头赤石脂汤低、中、高剂量组心肌CX43表达(0.350±0.005、0.353±0.015、0.365±0.020)不同程度的上调，分布较为均匀，且心肌纤维排列整齐，中剂量组和高剂量组尤为明显；尿激酶组心肌组织中CX43蛋白表达(0.328±0.022)增加，散在分布，心肌纤维排列较为整齐，见图3。

图3 免疫荧光染色观察乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心肌组织中CX43蛋白含量的影响(×400)

3 讨 论

早期的药物溶栓是AMI发生后临床首选的治疗方案，以通过及时恢复冠状动脉血流的方式来保护心肌细胞，减少心肌细胞的坏死，抑制心室重构的发生，延缓心功能恶化。AMI后心肌细胞的坏死促使了炎症反应的发生，过度的炎症反应则会扩大心肌缺血的范围并造成心肌进一步的损伤，加剧了心室重构和心肌纤维化发展的进程，严重影响了患者的心功能，增加了发生心律失常、心力衰竭等的风险，降低了急性心血管病患者的生存率〔6〕。

有研究表明，心功能的恶化与AMI患者的血清炎性因子水平呈负相关，因此CRP、IL-6、BNP水平的升高提示了心肌损伤的程度，所以血清炎性因子的水平对判断AMI的预后有十分重要的实际意义〔7,8〕。基于此，本研究进一步探究了AMI后血清炎性因子的水平对心功能的影响。CRP是由肝脏分泌的炎症反应蛋白，AMI时CRP升高且与AMI面积呈正相关。CRP作为炎症反应常见的介质，在急性血栓形成过程中起到促进作用，是预测AMI发生的重要标志物〔9〕。炎症反应是否进一步参与AMI的心室重构，影响AMI的预后已成为研究的新热点。IL-6是一种单链糖蛋白细胞因子，是急性炎症时由单核细胞等分泌的蛋白〔10〕。在机体抗感染的免疫反应中IL-6起到了十分重要的作用，是诊断急性感染早期的灵敏指标。BNP主要由心肌细胞合成分泌，是一种心脏神经类激素，主要反映心室肌的张力和心脏容量负荷的改变，也是反映机体心功能的重要因素〔11〕。急性心肌缺血能够刺激脑钠肽的分泌，且参与AMI的心室重构，严重心室重构则导致心力衰竭的发生，因此BNP的早期监测对于AMI预后有十分重要的意义。

乌头赤石脂丸主要用于AMI等急性心血管疾病，主要病机为“阳微阴弦”，即上焦阳气极虚、下焦阴寒痼结、痰饮闭阻心胸而发病。方中乌附为大辛大热的药物，实为峻逐阴寒、除湿化饮止痛之品，同用可急救于危难之时，迅速起效；蜀椒、干姜散其寒以振奋阳气、调畅气血，在一派大辛大热的药物之中，配伍赤石脂既可以收敛阳气，也能固涩止血又可防止辛温药物发散太过。现代药理学研究表明，乌头和附子具有抗心肌缺氧、抗凝血和抗心律失常等作用，附子还具有改善血液循环，促进血流量的作用，临床研究中发现附子可抑制急性炎症〔12〕。干姜主要的化学成分是挥发油，其中α-姜烯含量最高，具有解热、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集的作用，其中挥发油中所含的辛辣成分有改善局部血液循环的作用，实验研究表明，干姜水煎剂可以通过调控AMI大鼠血清中炎症因子的含量达到改善心肌缺氧的状态目的。基于附子无干姜不热的理论基础，研究表明附子与干姜的配伍可减少心肌细胞凋亡而保护心肌细胞〔13,14〕。蜀椒中主要含有的有效成分是挥发油，其中桉树脑、4-萜品醇、D-柠檬油精、β-月桂烯、α-蒎烯含量较高，有研究表明蜀椒所含的挥发油对于急慢性炎症有很好的抑制作用，且有一定的镇痛作用〔15〕。乌头赤石脂丸方诸药合用才能更好地发挥温阳散寒、祛寒止痛的功效。有临床实践证实，乌头赤石脂汤可以改善老年缺血性心肌病，提高患者生活质量，其可能与降低血清中TNF-α、BNP的水平有关〔16〕。

综上，乌头赤石脂丸方可以显著改善AMI大鼠模型的心功能，降低血清炎性因子CRP、IL-6的水平，有效地抑制心肌细胞凋亡；降低血清中BNP的含量，一定程度上抑制了心肌纤维化，延缓了心室重构的进程；可延长凝血酶原时间，降低纤维蛋白原的含量，改善了其血液黏度，防止血栓进一步形成而造成二次伤害；心肌细胞CX43蛋白表达有效增加，缝隙连接蛋白正常工作，减少心律失常和心力衰竭的发生，有效改善了心肌纤维化。