软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞的保护作用及机制研究

周红力

《2016年中国心血管病年报》表明，我国约有2.9亿人患心血管疾病。高血压是心血管疾病的主要危险因素之一[1]。高血压可引起多种重要脏器病变，包括微量蛋白尿和动脉粥样硬化等，并与不良心血管事件、脑血管疾病和肾脏疾病密切相关。而动脉粥样硬化是缺血性脑卒中的高危因素之一。目前，西医治疗(如他汀类降脂药)是动脉粥样硬化的主要治疗方式，然而长期服用会引起肾衰竭、横纹肌溶解等不良反应[2]。软脉化斑汤为我国著名老中医陈学忠根据化瘀通脉、补肾活血的学术指导思想研制的用于治疗动脉斑块的基础方。近年来，有研究发现软脉化斑汤对动脉斑块病人有显著疗效。佘滟等[3]研究发现，软脉化斑汤能够改善动脉粥样硬化病人的颈动脉内中膜厚度、颈动脉粥样硬化斑块积分以及中医证候。但是，目前学术界关于软脉化斑汤对动脉粥样硬化疗效的相关机制尚不清楚。本研究通过建立高血压合并动脉粥样硬化大鼠模型，观察软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠血管内皮细胞的保护作用，并探讨软脉化斑汤抗动脉粥样硬化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 20只8周龄雄性自发性高血压大鼠(200 g)和10只8周龄WKY雄性大鼠(200 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 实验药品 软脉化斑汤(桑叶15 g，蒲公英25 g，土鳖虫15 g，山楂30 g，姜黄15 g，丹参30 g，淫羊藿25 g，灵芝20 g)加工成含原生药1∶1的液体，即浓度为1 g/mL。

1.1.3 实验材料 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。白介素6(IL-6)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、超敏C反应蛋白(hs-CRP)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒，均购自武汉博士德生物公司。兔抗血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体、兔抗G蛋白信号调节因子16(RGS16)抗体和兔抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体均购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 将20只8周龄雄性自发性高血压大鼠随机分为模型组和软脉化斑汤组，每组10只。同时另设10只8周龄WKY雄性大鼠作为空白对照组。

1.2.2 给药方法 模型组大鼠腹腔注射维生素D3(VD3)连续3 d，总剂量7×105U/kg。之后每天饲喂高脂饲料20 g(配方：3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料)，在饲喂高脂饲料的同时每天给予2 mL生理盐水进行灌胃，1次/日，持续8周。软脉化斑汤组在与模型组相同处理方式的基础上，给予生理盐水2 mL+软脉化斑汤2 mg/(kg·d)灌胃，每日1次，持续8周；空白对照组采用标准饲料喂养，并对每只大鼠腹腔注射与VD3等量的生理盐水，连续3 d，之后每天给予2 mL生理盐水灌胃，1次/日，持续8周。在第4周末，给予模型组和软脉化斑汤组大鼠腹腔注射总剂量为5×105U/kg的VD3，空白对照组给予腹腔注射等量的生理盐水。模型组和软脉化斑汤组各有1只大鼠死亡，空白对照组大鼠无死亡。

1.2.3 检测指标及方法

1.2.3.1 尾动脉血压 在实验前、干预4周和干预8周分别采用RBP-1B大鼠血压计测量尾动脉血压。重复测量3次，取其平均值。

1.2.3.2 血脂水平 实验结束后，通过颈动脉插管取血，以3 000 r/min的转速离心15 min，留取上清备用。采用全自动生化分析仪测量大鼠三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。

1.2.3.3 炎性因子及氧化水平 采用ELISA法测定大鼠血清中IL-6、hs-CRP和TNF-α含量。通过硫代巴比妥酸法检测大鼠血清中MDA含量，通过黄嘌呤氧化法检测大鼠血清中SOD水平，采用化学比色法检测大鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)水平。

1.2.3.4 苏木素-伊红(HE)染色分析血管组织病理形态 实验结束后大鼠禁食12 h，断头并迅速切除胸主动脉，切取胸主动脉下段1 cm，并用10%甲醛缓冲液进行固定，然后采用75%乙醇进行梯度脱水，并用二甲苯透明、石蜡包埋、切片，行常规HE染色，采用光学显微镜观察血管组织病理形态。

1.2.3.5 免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 取各组大鼠胸主动脉血管约50 mg，经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。在冰浴条件下，将浸泡在Trizol裂解液里的组织快速研磨成匀浆。采用蛋白提取试剂盒(北京索莱宝公司)提取匀浆蛋白。采用双喹啉酸(BCA)法定量后，通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。采用5%脱脂奶粉进行封闭1 h。并在室温下采用兔抗VCAM-1抗体、兔抗RGS16抗体和兔抗GAPDH抗体孵育1 h。使用ImageQuant LAS 500超敏感化学发光成像仪曝光后，通过Imag J软件分析蛋白条带的灰度，以目标灰度值与内参GAPDH灰度值比值代表目标蛋白含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。定量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠血压的影响 与空白对照组比较，干预前、干预4周及8周模型组血压明显升高(P<0.05)；与模型组比较，干预4周、8周软脉化斑汤组血压明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠干预前、干预4周及8周血压比较(x±s) 单位：mmHg

2.2 软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠血脂水平的影响 与对照组比较，模型组血清TG、TC和LDL-C水平均明显升高(P<0.05)，HDL-C水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较，软脉化斑汤组TG、TC、LDL-C水平均明显降低(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠血脂水平比较(x±s) 单位：mmol/L

2.3 软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠炎性因子水平的影响 与空白对照组比较，模型组血清IL-6、hs-CRP及TNF-α水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，软脉化斑汤组IL-6、hs-CRP及TNF-α水平均降低(P<0.05)。详见表3。

表3 3组大鼠炎性因子水平比较(x±s) 单位：pg/mL

2.4 软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠MDA、SOD、T-AOC的影响 与空白对照组比较，模型组血清MDA含量升高(P<0.05)，而T-AOC和SOD含量降低(P<0.05)；与模型组比较，软脉化斑汤组MDA含量降低(P<0.05)，SOD和T-AOC升高(P<0.05)。详见表4。

表4 3组大鼠MDA、SOD及T-AOC水平比较 (x±s)

2.5 各组大鼠血管组织病理学形态 光学显微镜下显示，模型组大鼠有明显的血管增生，内皮细胞排列紊乱，可见多个不规则条纹(见图1a)；软脉化斑汤组大鼠血管内皮增生有一定的改善(见图1b)；空白对照组大鼠血管内膜光滑，薄而完整，细胞排列整齐(见图1c)。

图1 各组大鼠主动脉的组织病理形态

2.6 软脉化斑汤对高血压合并动脉粥样硬化大鼠血管组织VCAM-1及RGS16蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型组血管组织VCAM-1和RGS16蛋白表达水平均升高(P<0.05)；与模型组比较，软脉化斑汤组大鼠血管组织VCAM-1和RGS16蛋白表达水平均降低(P<0.05)。详见表5、图2。

表5 3组大鼠VCAM-1及RGS16蛋白表达水平比较 (x±s)

图2 Western Blot检测结果

3 讨 论

高血压以及其他心脏代谢紊乱参数被认为是心血管疾病的危险因素。与健康人群相比，患有心脏代谢异常的病人更容易发生脑血管并发症(如动脉粥样硬化、缺血性中风和心肌梗死)。高血压可通过内皮功能损害和血管壁脂质分子的积累，逐渐引起一系列氧化应激和炎症反应，最终导致动脉粥样硬化的发生[4]。对高血压等心脏代谢紊乱进行早期干预可预防动脉粥样硬化[5]。中药具有多靶点、多途径的优势，可以为动脉粥样硬化的治疗提供新的选择[6-7]。佘滟等[3]研究发现，软脉化斑汤能够改善动脉粥样硬化病人的颈动脉内中膜厚度、颈动脉粥样硬化斑块积分及中医证候。但是，目前学术界关于软脉化斑汤对动脉粥样硬化疗效的相关机制尚不清楚。本研究通过联合大剂量VD3和高脂饲料复制出高血压合并动脉粥样硬化大鼠模型，结果发现软脉化斑汤可降低高血压动脉粥样硬化大鼠的血压和血脂水平。

嗜中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞可浸润吞噬脂质分子，然后将其转化为泡沫细胞并产生大量炎性细胞因子，如白介素、hs-CRP等，导致内皮功能障碍[8]。有学者发现，氧化应激在内皮功能障碍过程中也发挥着复杂和关键的作用[9]。本研究发现，软脉化斑汤可以降低高血压合并动脉粥样硬化大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α，提示软脉化斑汤可通过降低炎症反应对动脉粥样硬化起治疗作用。SOD在体内抗氧化系统中起着重要的作用，其活性可以反映脂质过氧化的程度和组织中自由基的含量[10]。也有研究发现，SOD和T-AOC可以显著抑制高脂血症大鼠血浆及动脉壁中脂质过氧化物代谢产物的产生以及动脉斑块的形成，进而抑制动脉粥样硬化的发生发展[11]。软脉化斑汤可以降低高血压合并动脉粥样硬化大鼠血清MDA水平，提高SOD和T-AOC含量，进而抑制脂质过氧化，对血管内皮功能起保护作用。

本研究发现，软脉化斑汤可抑制VCAM-1和RGS16的表达。VCAM-1是一种跨膜蛋白，它参与白细胞或淋巴细胞与其他细胞之间的相互作用，并可以诱导免疫细胞通过血管壁进入组织，进而起到炎症损伤的作用[12]。研究发现，VCAM-1与类风湿关节炎、伤口修复和肿瘤生长的调节密切相关[13-14]，VCAM-1在血管增生中起关键作用，这些疾病和动脉粥样硬化均与血管增生的发生密切相关。RGS16是参与G蛋白信号转导家族的成员之一，其可能参与细胞应激反应[15]。有学者认为G蛋白信号调节因子蛋白在心血管功能障碍的发病机制中发挥重要作用[16]。

综上所述，软脉化斑汤可有效改善高血压合并动脉粥样硬化大鼠血压及血脂代谢水平，保护血管内皮细胞损伤，其机制可能与抑制炎症反应、氧化应激及下调VCAM-1、GRS16蛋白表达有关。