幽门螺杆菌感染病儿胃黏膜组织微小RNA-497-3p表达及与Toll样受体8/Toll样受体10/核因子κB信号通路的相关性

彭丹，陈国强，董琳，陈霞

作者单位：1黄冈市中心医院，a检验科，b儿科，湖北 黄冈438000；2湖北文理学院附属医院、襄阳市中心医院儿科，湖北 襄阳441021

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）感染作为胃黏膜病变的主要致病因素，它能诱导胃黏膜上皮细胞的损伤，诱发胃炎、消化道溃疡，并在胃癌的发生发展过程中起着重要作用。近年来，儿童的HP感染阳性率呈逐年上升趋势，胃炎、胃溃疡在儿童中的发病率也不断升高。微小RNA（MicroRNAs，miRNA）是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，它通过与特定mRNA 结合，影响转录过程，调控细胞的生理过程。许多研究表明，微小RNA 是一种非常重要的调控因子，参与炎症、癌症等多种疾病的调控。JI 等MicroRNA-132 通过靶向HT-22 神经细胞中的TRAF6，减轻脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤；Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）是一类模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRRs），受病原体相关分子模式（PAMPs）的刺激，产生抗原触发的先天和适应性免疫反应。最近的研究表明，免疫细胞中的TLR 激活可诱导多种小的调控RNA，称为MicroRNAs，许多MicroRNA 可以通过积极或消极调节TLR 信号来控制炎症过程和对感染的反应。Garo 等研究显示，异常的miR-155表达参与了多种免疫过程，包括多种自身免疫性疾病和癌症的发病机制。然而，miR-497-3p在Hp感染病儿胃黏膜组织中的表达情况以及作用机制尚不清楚。鉴于此，本研究通过检测miR-497-3p 在Hp 感染病儿胃黏膜组织中的表达情况，分析其表达水平，探讨其与核因子（NF）-κB 信号通路的相关性，以期为Hp感染致病机制的研究提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014 年1月至2018 年11 月于黄冈市中心医院就诊的病儿210 例，其中男性120例，女性90例，年龄（10.54±3.21）岁，年龄范围为4～14 岁。病儿经组织病理Hp 染色和C 尿素呼气试验检查，将病儿分为Hp 感染组和Hp 非感染组。Hp感染组100 例，男58 例，女42 例，年龄（10.43±2.12）岁；Hp 非 感 染组110 例，男62 例，女48 例，年龄（10.25±2.56）岁，按其病因可分为饮食、药物刺激和胆汁反流。两组性别和年龄比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。入选标准：有反酸、呕吐、腹部不适、恶心、黑便或呕血症状，且近2 个月无铋剂、抗菌药物、离子泵阻滞剂、激素、质子泵抑制剂使用史。排除标准：有心、肝、肾功能不全，营养不良，感染病，免疫系统和内分泌系统功能异常，恶性肿瘤。病儿及其监护人知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂及仪器

RNA 提取试剂Trizol 购自美国Invitrogen 公司，逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq试剂盒均购自日本TaKaRa 公司。miR-497-3p、Toll样受体8（TLR8）、Toll 样受体10（TLR10）、NF-κB mRNA 和内参GAPDH 引物设计及合成皆由上海生工生物公司设计完成。荧光PCR 检测系统购自BIO-RAD（美国）。肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-10（IL-10）ELISA 试剂盒购自Thermofisher 公司（美国）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 病儿行Hp 检测及胃镜检查前需禁食6 h。Hp 检测，病儿口服C 尿素胶囊，30 min行呼气试验。采用红外线能谱仪检测标本C 的原子峰值。病儿胃镜检查时，留取病儿胃窦部和胃黏膜组织置于-80 ℃冰箱用于聚合酶链式反应（PCR）检测和酶联免疫吸附测定（ELISA）。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验 采用qRT-PCR 方法检测胃黏膜组织中miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF-Kb mRNA 的 表 达 水 平。用TRIzol 提取组织中的总RNA，取1 000 ng 总RNA，按照TaKaRa 试剂盒的说明书将其逆转为cDNA。以逆转好的cDNA 为转录模板，qRT-PCR 试剂盒和引物为试剂，按以下PCR 转录条件：预变性95 ℃30 s一个外循环；PCR 反应阶段是40 个循环，每个循环为95 ℃5 s 和60 ℃30 s 进行PCR 扩增反应。结果GAPDH 作 为 内 参，采 用2法 计 算miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-κB mRNA的相对表达量。

miR-497-3p的引物序列为：

正向：5′-CAGCAGCACACUGUGGUUUGUA-3′

反向：5′-CAAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′

TLR8的引物序列为：

正向：5′-ATGTTCCTTCAGTCGTCAATGC-3′

反向：5′-TTGCTGCACTCTGCAATAACT-3′

TLR10的引物序列为：

正向：5′-GGTTCTTTTGCGTGATGGAATC-3′

反向：5′-GGTCGTCCCAGAGTAAATCAAC-3′

NF-Kb的引物序列为：

正向：5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′

反向：5′-CCATCACGCAAAAGAACCCAG-3′

GAPDH的引物序列为：

正向：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′

反向：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′

1.3.3

ELISA 实验 ELISA 实验检测病儿胃黏膜组织中的炎性因子的表达。将组织制备为匀浆，按照试剂盒的说明书，离心提取上清液，检测黏膜组织中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

1.4 统计学方法

实验数据均采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。观测资料主要是计量数据，用x ± s表示，组间比较采用t检验，变量间相关性分析采用Pearson 相关分析，以P ＜0.01 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miR-497-3p、TLR8、TLR10 和NF

-κ

B 表达水平比较

与Hp 非感染组比较，Hp 感染组胃黏膜组织中miR-497-3p水平下调，TLR8、TLR10和NFκB 水平均上调，均差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

表1 幽门螺杆菌（Hp）感染组与Hp非感染组胃黏膜组织中miR-497-3p、TLR8、TLR10和NF-Kb表达水平比较/x ± s

2.2 两组TNF-

α

、IL-6 、IL

-

8 和IL

-

10 表达水平比较

与Hp 非感染组比较，Hp 感染组胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的水平均上调，均差异有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

2.3 miRNA-497-3p 的表达水平用于诊断Hp 感染ROC 曲线

以Hp 感染组为阳性样本（n= 100），以Hp 非感染组为阴性样本（n = 110），再将miRNA-497-3p 指标水平划分成7～8 个组段，建立接收者工作特征曲线（receiver operation characteristic，ROC）诊断分析模型。经ROC 分析知：miRNA-497-3p 诊断Hp感染的ROC 曲线下面积（AUC）为0.926（标准误0.023，95%CI：0.824～0.912）。取1.025 为诊断Hp感染的临界值，其相应的敏感度和特异度分别为91.8%和93.7%。

表2 幽门螺杆菌（Hp）感染组与Hp非感染组胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10表达水平比较/x ± s

图1 胃黏膜组织中miR-497-3p的ROC曲线

2.4 相关性分析

Hp 感染组胃黏膜组织中miR-497-3p 分别与TLR8、TLR10、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10 的mRNA 水平呈 现 负相关性（r = -0.516，r=-0.492，r=-0.366，r=-0.342，r=-0.418，r=-0.406，r=-0.432，P ＜0.05）。

3 讨论

Hp 是一级致癌因子，它与慢性胃炎、胃癌和消化性溃疡等多种胃肠道疾病的发病密切相关。儿童是HP 感染的易感染人群，儿童感染Hp 后机体不能自然清除，不进行治疗将会处于终身持续感染状态。有研究表明Hp 感染能引起胃黏膜组织中炎性因子的变化导致疾病的发生。本研究结果显示，Hp 感染组病儿胃黏膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8 和IL-10水平均高于Hp非感染组，说明Hp感染病儿胃黏膜组织中炎性因子水平升高，可能是Hp 感染的一个致病因素。

MicroRNA（miRNA）是一类长度约为20～24 个核苷酸没有编码能力的微小RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，是基因表达的基本调控机制。近年来，许多研究表明，miRNA 在人类癌症的发展、上皮-间质转化和耐药性中发挥重要作用。例如，miRNA 可以与信号通路相互作用，通过影响癌细胞迁移、侵袭、血管生成和增殖来调控肿瘤 转 移。特 异 性miRNA 在Hp 感 染 组 织 中 表达，miRNAs 的异常表达在Hp 感染致病过程中起着关键性作用。研究显示miR-24-3p 在胃黏膜病变早期表达较高，Hp 能在胃黏膜损伤早期参与miR-24-3p 的调控，使miR-24-3p 在胃黏膜组织中的表达减少，导致胃黏膜病变加重。Xie 等研究发现miR-152 和miR-200b 靶向调控B7-H1 的表达促进胃癌的发生发展。Li 等研究证明MicroRNA-187 通过抑制FOXA2，从而促进胃癌的发生和发展。本研究实时定量PCR 结果显示Hp 感染组胃黏膜组织中miR-497-3p mRNA 表达量低于Hp 非感 染 组，说 明miR-497-3p 可能参 与了Hp 感染的致病过程。

HP感染与慢性胃炎、胃癌和消化性溃疡等多种胃肠道疾病的发病密切相关。经Targetscan 网站预测miR-497-3p 的靶基因有TLR8、TLR10。而TLR8、TLR10 是Toll 样受体家族成员，而Toll 样受体家族是调控机体炎性反应的重要通路，在促进炎性反应及多种炎性因子释放中发挥重要作用。Young 等研究显示miR-21 可作为TLR8 的内源性配体，激活TRL8，促进系统性红斑狼疮（SLE）的发病。Hp可激活TLR10，促进IL-8 和TNF 炎性因子的分泌。本研究结果显示，Hp 感染组胃黏膜组织中TLR8、TLR10 和NF-κB mRNA 相对表达量均高于Hp 非感染组，说明TLR8/TLR10/NF-κB 信号通路可能参与Hp 感染致病过程。相关分析结果显示，Hp 感染组胃黏膜组织中miR-497-3p 相对表达量与TLR8、TLR10 mRNA 和NF-κB mRNA 相对表达量，IL-6、IL-8、IL-10 和TNF-α 水平均呈负相关，进一步说明miR-497-3p 可能通过调控TLR8/TLR10/NF-κB 信号通路介导的炎性反应而在Hp 感染致病过程中发挥重要作用。

综上所述，miR-497-3p在Hp感染病儿的胃黏膜组织中的异常低表达，其可能是通过影响TLR8/TLR10/NF-κB 信号通路介导的炎性反应，从而在Hp感染的致病过程中发挥作用，可为临床下一步的治疗提供思路。但是影响病儿Hp 感染的因素很多，其具体的发病机制及诊断尚需进一步深入研究，且在接下来的工作中会重点探讨miR-497-3p 影响病儿Hp感染具体的分子机制。