右美托咪定对减轻APP/PS1小鼠海马区炎性因子分泌及细胞凋亡的作用

宋云飞

作者单位：辽宁中医药大学附属医院药学部，辽宁 沈阳110032

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的一种中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现包括记忆障碍、失语失认、视空间能力和抽象计算能力损伤等。据2016 年的调查问卷显示全球约有4 千万人患有AD，且65 岁以上的老年人的发病率在4%～8%左右。随着人口老龄化进程的加快，开发治疗AD的药物已成为我国医药行业的重中之重。

右美托咪定（DEX）是一种相对选择性的α2-肾上腺素受体激动剂，适用于行全身麻醉的手术患者气管插管和机械通气时的镇静，同时还有抗交感、抑制应激反应、稳定血流动力学以及减少麻醉剂用量的作用。最新研究证明DEX 可抑制SIRT1 信号通路从而减少大鼠手术后的认知功能障碍的风险。而且，DEX 能抑制炎性因子的释放，发挥神经保护作用，从而改善老年大鼠认知功能障碍。但是DEX 是否对APP/PS1 双转基因模型小鼠的认知功能障碍有改善作用且是否能抑制海马区神经细胞炎症浸润以及凋亡还未见报道，所以本研究自2018 年3 月至2019 年3 月以APP/PS1 小鼠模型模拟AD，观测不同剂量DEX 对其海马区神经细胞的保护作用，为临床上治疗阿尔茨海默病提供一定的基础理论和依据。

1 材料与方法

1.1 动物

野生型SPF级C57BL/6小鼠购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号SCXK（苏）2017-0001；APP/PS1 双转基因C57BL/6 小鼠购自南京大学模式动物研究所，合格证号SXK（苏）2010-0021。所有被安置在一个符合SPF级标准的动物房间里，笼3～4 只小鼠，温度18～24 ℃，相对湿度55%～65%，每日光照或黑夜均为12 h，可自由取用食物和水。所有本研究中使用的实验方案得到了实验动物福利伦理委员会的批准。

1.2 试剂

盐酸右美托咪定购自江苏瑞恒医药股份有限公司；4-苯基丁酸（PBA）购自Sigma 公司；鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）购自Proteintech公司，兔抗B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和内质网应激蛋白（CHOP）购自Cell signaling technology公司；Nissl染色液和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒及蛋白上样缓冲液购自碧云天生物技术研究所；白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒购自江苏科特生物有限公司。

1.3 仪器

Morris 水迷宫系统（赞德仪器有限公司）；冰冻切片机（HM525，北京华兴科仪科技发展有限公司）；倒置荧光生物显微镜（FM-500，上海普丹），WB电泳仪和转膜仪（Bio-Rad）。

1.4 分组与治疗

取7 月龄APP/PS1 双转基因小鼠，随机分为模型组（TG）、DEX 低剂量组（TG+10 μg/kg DEX）、DEX 高剂量组（TG+20 μg/kg DEX）和PBA 阳性对照组（TG+400 mg/kg PBA），另取野生型C57BL/6 小鼠作为对照组（WT），每组6 只。每天腹腔注射DEX 一次，连续治疗4 周，TG 组和WT 组给予等量的0.9%氯化钠溶液。

1.5 水迷宫检测各组小鼠的学习记忆能力

治疗结束后，各组小鼠进行定位航行实验，实验共进行5 d（训练阶段+正式实验阶段），记录小鼠找到平台所需的时间（即为小鼠逃避潜伏期）并保存小鼠游泳轨迹图。第6天将平台撤除，进行空间探索实验。将小鼠从原平台所在象限的对侧头朝池壁缓慢放入水中，记录其60 s 内的游泳轨迹以及穿越平台的次数，并对所得数据进行比较分析。

1.6 Nissl 染色观测小鼠脑内海马神经细胞的数量

水迷宫实验结束后，将小鼠麻醉，4%多聚甲醛溶液心脏灌流，快速取出完整的脑组织，将其放入4%多聚甲醛溶液中固定，随后将其包埋于冰冻切片专用包埋剂中，置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻24 h，次日，进行连续冠状冰冻切片，片厚4 μm。行Nissl染色：将小鼠脑冰冻切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇溶液中进行脱脂处理30 s，双蒸水洗涤切片3 次，每次30 s；将切片浸入甲酚紫染液，56 ℃染色1 h，双蒸水洗涤3 次，每次30 s；中性分色液分色2 min，浸入100%乙醇中30 s，浸入二甲苯透明1 min，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.7 TUNEL 法检测各组小鼠海马区细胞凋亡的影响

4%多聚甲醛固定小鼠脑切片30 min，PBS 洗涤；1%Triton X-100 透化5 min，PBS 洗涤；每个脑组织滴加50 μL TdT 酶反应液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤；随后每个脑组织滴加50 μL荧光标记液，37 ℃避光孵育0.5 h，PBS 洗涤；DAPI 染色液进行细胞核染色，避光孵育10 min，PBS 洗涤；置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.8 ELISA 检测小鼠海马中IL

-

1

β

、IL

-

6 及TNF

-α

的含量

酶联免疫吸附剂测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测各组小鼠海马组织匀浆中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.9 Western Blot 检测小鼠海马中凋亡相关蛋白和内质网应激相关蛋白表达情况

提取各组小鼠海马组织总蛋白，使用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量并统一浓度，加入蛋白上样缓冲液并加热煮沸使蛋白变性，随后先后进行SDS-PAGE 电泳、转膜、抗体孵育及显色后，凝胶成像分析系统扫描，测定光密度。一抗与二抗稀释浓度均为1∶1 000。采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果进行统计分析。

1.10 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 软件进行分析处理。数据表示为x ± s，多组间均数的比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t 法，以P ＜0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEX 改善APP/PS1 双转基因小鼠学习与记忆

能力

Morris 定位航行实验结果显示，经过5 d 的定位航行训练，最后一天实验中WT 组潜伏期最短为（8.35±2.24）s，TG 组的潜伏期最长为（28.63±3.87）s，两者相比差异有统计学意义（P ＜0.01），而给予了低高剂量DEX 和PBA 的TG 小鼠与TG 组相比，潜伏期 明 显 缩 短 为（19.56±5.94）s、（14.52±4.03）s 和（12.75±3.51）s（P ＜0.01），说明DEX 能提高APP/PS1小鼠的学习能力。

空间探索实验结果显示，WT 组平均穿越平台次数（6.50±1.04）次，TG 组平均穿越平台（3.0±0.89）次，两者相比差异有统计学意义（P ＜0.01），而给予了低高剂量DEX 和PBA 的TG 小鼠与TG 组相比，穿越平台次数明显增多为（3.5±1.05）s、（5.5±1.05）s 和（5.83±1.17）s，差异有统计学意义（P ＜0.05）；不同组间均数比较，F=12.835，P＜0.001，说明DEX 能提高APP/PS1小鼠的记忆能力。见表1和图1。

2.2 DEX 明显增多APP/PS1 小鼠海马神经元数量

Nissl 染色结果显示，WT 组小鼠海马区尼氏小体排列紧密，数量较多，而TG 组海马区尼氏小体数量明显减少；给予DEX 治疗的APP/PS1 小鼠海马区尼氏小体数量明显增多，说明DEX 明显增多APP/PS1小鼠海马神经元数量（图2）。

2.3 DEX 抑制APP/PS1 小鼠海马区细胞的凋亡

与WT 组相比，TG 组小鼠海马区细胞凋亡数显著增多（183.67±20.32）个/毫米TG 比（17.17±6.74）个/毫米WT（P＜0.01）。与TG 组相比，低高剂量DEX 组和PBA 组小鼠海马区细胞的凋亡数明显减少至（139.0±16.44）个/毫米，（112.67±13.79）个/毫米和（108.67±16.80）个/毫米（P ＜0.01），且不同组间均数比较，F=92.830，P＜0.001，说明DEX 可以抑制TG小鼠海马区细胞的凋亡。见图3。

2.4 DEX 降低APP/PS1 小鼠海马IL

-

1

β

、IL

-

6 及TNF

-α

含量

与WT 组相比，APP/PS1 小鼠海马区IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.01）；而经DEX 和PBA 治疗后，APP/PS1小鼠海马区促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α 水平明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.01），说明DEX 能够抑制APP/PS1小鼠海马区炎症反应（表2）。

2.5 DEX 抑制APP/PS1 小鼠海马区凋亡蛋白的表达

与WT 组相比，TG 组Bax/Bcl-2 比例和活化的caspase-3（cleaved caspase-3）表 达 量明显增加 至（3.43±0.68）和（2.77±0.40），差异有统计学意义（P ＜0.01）；低高剂量DEX 和PBA 组能降低Bax/Bcl-2 比例和活化的caspase-3 的相对表达，差异有统计学意义（P ＜0.01），且不同组间均数比较，F=17.956，P＜0.001（Bax/Bcl-2 比例），F=25.676，P＜0.001（cleaved caspase-3）；说明DEX 通过抑制TG 小鼠海马区Bax/Bcl-2 比例和caspase-3 的活化发挥抗凋亡作用。电泳图见图4。

图4 WB检测各组小鼠海马区凋亡相关蛋白的表达

2.6 DMED 降 低APP/PS1 小 鼠 海 马GRP78 和CHOP 蛋白的表达

与WT 组相比，TG 组GRP78 和CHOP 表达量明显增加，增加至2 倍以上，差异有统计学意义（P ＜0.01）；低高剂量DEX 和PBA 组能降低GRP78 和CHOP 的表达，差异有统计学意义（P ＜0.01），说明DEX通过抑制内质网应激相关蛋白的表达发挥抗炎抗凋亡作用。见表3和图5。

表1 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期结果/（s，±s）

表2 各组小鼠海马区炎性因子的表达/±s

表3 各组小鼠海马区GRP78和CHOP蛋白的表达/±s

图5 各组小鼠海马区葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和内质网应激蛋白(CHOP)表达

3 讨论

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性中枢神经退行性疾病，其特征是记忆力受损和认知功能受损。AD 的主要临床特征是精神和行为功能逐渐下降引起的精神丧失、失认、失语、失用症和情绪失调。其主要病理特征是淀粉样斑块、神经原纤维缠结及神经元丢失等。目前AD 的发病机制尚不明确，可能是环境、生活方式及遗传因素相互作用的结果。尽管科学家们竭尽全力地研究AD 的防治方法，但很少有有效的治疗方法，这给人类和社会带来越来越大的负担。在针对AD 寻找有效治疗方法的失败使我们意识到了对AD 发病机制的认识不足。本研究采用7 月龄的APP/PS1 小鼠作为AD 模型研究，采用定位航行实验和空间探索实验检测DEX 对其学习与记忆能力。实验结果（表1和图1）发现与WT组相比，TG 组小鼠经历了更久的逃避潜伏期，并且穿越平台的次数显著减少；而给予DEX 腹腔治疗的TG小鼠不仅能够缩短平均逃避潜伏期，而且延长其穿越平台的次数。因此，我们得出DEX 能够提高TG 小鼠的空间学习与记忆能力，且与剂量呈依赖性。

众所周知，海马是调控大脑的学习记忆以及认知功能的重要区域，当海马神经元被破坏后，其学习和记忆功能必将紊乱。生理状态下，脑内微环境处于一个自我调控的稳定状态，脑内微环境一旦受到外来或自身性损伤，处于静息状态的小胶质细胞被激活，清除致病因子以及凋亡的神经细胞从而发挥着免疫作用与营养作用。在AD 脑中，小胶质细胞可以迁移到斑块附近，释放一些抗炎因子，如IL-4、10及13等来调节脑内微环境。但是这些小胶质细胞没有降解Aβ 的能力，反而产生的慢性炎性反应对其附近的神经细胞造成严重损伤。体外研究发现Aβ 可激活小胶质细胞进而诱导促炎性因子的释放，包括炎性因子IL-1、2、6、8、TNF-α 等，导致神经细胞损伤乃至死亡，造成一种神经细胞受损和Aβ 沉积的恶性循环。科学家通过比较AD患者和正常人的血样发现，AD 患者脑脊液和血浆中IL-6 水平升高，而肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体水平降低，说明炎症反应在AD 发病过程中持续存在。本研究结果发现，与WT 组小鼠相比，TG小鼠脑内海马区尼氏小体数目明显减少，TUNEL 阳性细胞数明显增加，而给予DEX 后TG 小鼠脑内海马区尼氏小体显著增多，TUNEL 阳性细胞数明显减少，且Bax/Bcl-2 的比值以及活化的Caspase-3 的表达显著降低，这些证据都说明DEX 能抑制细胞凋亡，促进神经元的存活。在此基础上，我们用ELISA法检测了各组小鼠海马区相关炎性因子的表达。表2 结果显示TG 小鼠海马区IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量较WT 组明显升高，DEX 治疗后IL-1β、IL-6和TNF-α 增强的作用被逆转，这些都充分的说明了DEX 对炎症反应的抑制作用，也进一步说明了DEX通过减少脑内海马区炎性因子的表达，促进神经元的存活发挥治疗AD的作用。

内质网是真核细胞内一个承担着重要生理功能的细胞器，为蛋白质的合成、折叠、运输和细胞内钙的储存提供了主要的场所。当细胞受到一些内外界刺激（缺氧缺血、营养过剩或缺失、氧化应激、病毒感染、基因突变等）时，都有可能引起内质网上钙离子通道的改变，出现钙剥夺或钙超载，进而影响内质网的功能，导致正常蛋白质的合成能力不足，而错误蛋白质折叠增多，引起内质网应激（ERstress）。内质网应激反应首先启动细胞内的生存途径——未折叠蛋白质响应（unfolded protein response，UPR），通过加强蛋白质正确的折叠，清除错误折叠蛋白质，使内质网稳态恢复平衡。具体效应主要是堆积在内质网中的未折叠蛋白质或错误折叠的蛋白质作为信号，活化内质网膜上伴侣基因蛋白（GRP78），使GRP78 与膜上蛋白解离，优先与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，使其正确折叠，使细胞适应ER stress。但强烈持续的ER-stress反应将启动细胞的凋亡途径来清理这些“妥协的细胞”，如CHOP蛋白是ER-stress诱导产生的凋亡信号分子，是ER-stress 细胞凋亡反应的直接结果。所以本研究以GRP78 和CHOP 表达为指标检测DEX 治疗AD 的机制，结果显示TG 小鼠海马区GRP78 和CHOP 的表达较WT 组明显升高，DEX 治疗后GRP78和CHOP增强的作用被抑制。为了进一步证实DEX 对AD 的治疗效果，我们采用了ERstress 的抑制剂PBA 作为阳性对照。结果发现高剂量DEX与PBA的治疗效果相当。

综上所述，DEX 可以改善TG 小鼠学习与记忆能力，并且证实DEX 是通过抑制脑内海马区内质网应激，从而减轻炎症反应，抑制神经细胞的凋亡促进神经元存活发挥治疗作用，但是其具体作用机制仍需进一步研究。为治疗AD 等神经退行性疾病开辟了新的途径，具有广阔的临床应用前景和重大的社会经济价值。

（本文图1～3见插图2-2）