人类表皮生长因子受体2对胃癌细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

刘文杰，吴菡，黄建，周武碧

作者单位：南京医科大学附属淮安第一医院病理科，江苏 淮安223300

胃癌（GC）通常预后较差，目前是全球第四大常见癌症，且是东亚地区最常见的癌症。尽管已提出许多策略来提高病人存活率，但晚期GC 患者的中位存活时间仍为约12 个月。因此，需要更深入的探讨胃癌的分子发病机制，以改进胃癌治疗的新方法。人类表皮生长因子受体2（HER2）属于表皮生长因子受体（EGFR）家族成员，其在细胞生长、分化、存活相关通路中具有重要作用。市面上最常见的人源化的抗HER2 单抗为曲妥珠单抗，其可通过抑制HER2 二聚体、胞内吞HER2 及抗体依赖细胞介导的细胞毒等途径抑制肿瘤的恶化。大量研究报道，HER2 在胃癌患者中的表达异常升高。但是，HER2 对胃癌细胞生物性行为的影响未有研究。2018年11月至2019年6月进行本研究，拟通过检测胃癌细胞中HER2 的表达，探讨过表达HER2、敲减HER2 对胃癌细胞增殖、迁移侵袭及凋亡的影响，旨在揭示HER2在胃癌进展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

永生化的正常胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823均购自美国菌种保藏中心；噻唑蓝试剂（MTT）、胰蛋白酶均购自美国Sellect 公司；Lipofectamine2000、逆转录试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒购自大连Takara 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自德国罗氏诊断有限公司；放射免疫沉淀测定（RIPA）蛋白裂解液和电化学发光（ECL）试剂盒均购自碧云天生物技术公司；Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Coming公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823以及正常胃上皮细胞GES-1均用含10%胎牛血清的DMEM 培养基进行常规培养（37 ℃，含5%二氧化碳）。用胰蛋白酶消化75%汇合细胞，按照1∶3的比例更换培养基，每周传代3次。

1.2.2 细胞转染与分组 将正常培养的永生化的正常胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 分别标记为GES-1 组、SGC-7901 组、MGC-803 组、BGC-823 组；将SGC-7901 细胞采用随机数字表法分为pcDNA 3.1 组、pcDNA 3.1-HER2组、si-NC 组、si-HER2 组。处理方法为，按照脂质体Lipofectamine2000 的试剂盒说明书要求分别将pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-HER2、si-NC、si-HER2 转染至SGC-7901细胞，先用无血清培养液孵育6 h，再更换新鲜培养液继续培养48 h，western blot 法检测转染效果。收集转染成功细胞用于后续试验。

1.2.3 qRT-PCR 法检测细胞中HER2 mRNA 表达Trizol 法 提 取SGC-7901、MGC-803、BGC-823 以 及GES-1 细胞总RNA，微量核酸蛋白测定仪分析各样本RNA 浓度和纯度。调整RNA 样品浓度，使用Ta-KaRa 反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，进行qRTPCR 扩增。实验结果采用2法分析HER2（GAPDH作为内参）的相对表达。

1.2.4 MTT 实验检测细胞增殖 取适量pcDNA 3.1组、pcDNA 3.1-HER2组、si-NC组、si-HER2组细胞加入96 孔板，在培养24、48、72 h 时加入20 μL 的MTT工作液（5 g/L）孵育细胞4 h，弃去上清后，向各孔内添加150 μL 二甲基亚砜，缓慢振荡至结晶溶解，检测细胞在490 nm波长下吸光度（A）。细胞的增殖活力与各孔A值成正比。

1.2.5

Transwell 小室检测细胞迁移侵袭 将Transwell 小室置于添加500 μL 的RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清）24 孔板上，放入细胞培养箱平衡30 min。用纯RPMI 1640 培养基将pcDNA 3.1 组、pcDNA 3.1-HER2组、si-NC 组、si-HER2组细胞均配制成5×10个/毫升的细胞悬液。在上室内加入200 μL细胞悬液（细胞数约为1×10个）。常规培养24 h 取出上腔，去除上室膜上未迁移细胞，甲醇固定30 min，1 g/L 结晶紫染液染色20 min。双蒸水洗去染色液。将Transwell 小室放在倒置显微镜下拍照（400 倍），计数5个不同视野（上、下、左、右、中）的总细胞数取平均值记为迁移细胞数。

取60 μL 按照1∶8 比例稀释基质胶包被Transwell 小室上表面，置于培养箱当基质胶凝固后备用，其他步骤同迁移实验。

1.2.6

Annexin V-FITC/PI 流式细胞术实验 用500 μL 的Binding Bμffer 悬浮pcDNA 3.1 组、pcDNA 3.1-HER2 组、si-NC 组、si-HER2 组细胞，加入5 μL的Annexin V-/FITC 置于暗盒内反应20 min，再添加5 μL的PI反应20 min。用300目铜筛过滤后上流式细胞仪检测。采用早期凋亡率和晚期凋亡率之和表示细胞凋亡率。

1.2.7

Western Blot检测细胞中HER2、p16、p21、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、裂解的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的蛋白表达 将pcDNA 3.1组、pcDNA 3.1-HER2组、si-NC组、si-HER2组细胞置于冰上，用RIPA法提取各组细胞蛋白样品。定量后，向适量蛋白样品中加入4备体积的上样缓冲液（×5），经100 ℃加热10 min变性蛋白。每组均取60 μg样品按照100 V、110 min进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用标准湿式转膜装置20 mA转膜过夜。随后将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于孵育盒，室温下加入5%脱脂奶粉孵育1 h，再在4 ℃下加入1∶500～1∶1 000稀释的一抗孵育12 h，最后在室温下用1∶1 500稀释的二抗中反应2 h。将孵育盒置于暗室内，进行化学发光显影。凝胶成像系统采集图像，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，Quantity One 4.62软件分析目的条带相对灰度值表示目的蛋白表达量。

1.3 统计学方法

统计分析采用SPSS 21.0 软件进行。每个样本设置3 个生物学重复，实验重复3 次。计量资料用x ± s表示，采用t检验，多组间两两比较采用单因素方差分析和Bonferroni 校正的t 检验。P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞中HER2 的表达

SGC-7901、MGC-803、BGC-823 细 胞 中HER2 的mRNA 表 达（t =4.163，14.896，19.580；P = 0.0002，0.000，0.000）和蛋白表达（t = 20.834，15.497，13.957；P = 0.000，0.000，0.000）均显著高于GES-1细胞。见图1、表1。

图1 人类表皮生长因子受体2（HER2）在胃癌细胞中的蛋白表达

表1 人类表皮生长因子受体2（HER2）在胃癌细胞中的表达（n=9）/x ± s

2.2 过表达HER2 对胃癌细胞增殖的影响

pcDNA 3.1-HER2 组SGC-7901 细胞中HER2 表达高于pcDNA 3.1 组，细胞增殖活力（48、72 h 时）显著高于pcDNA 3.1组（P ＜0.05）。见图2、表2。

图2 过表达人类表皮生长因子受体2（HER2）的胃癌细胞中HER2蛋白表达

表2 过表达人类表皮生长因子受体2（HER2）对胃癌细胞增殖的影响（n=9）/x ± s

2.3 过表达HER2 对胃癌细胞迁移侵袭的影响

pcDNA 3.1-HER2 组SGC-7901 细胞中HER2 的蛋白表达显著高于pcDNA 3.1 组，细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均高于pcDNA 3.1 组（P ＜0.05）。见图3A、图3C，表3。

表3 过表达人类表皮生长因子受体2（HER2）对胃癌细胞迁移侵袭的影响（n=9）/x ± s

2.4 过表达HER2 对胃癌细胞凋亡的影响

pcDNA 3.1-HER2组SGC-7901细胞中HER2表达显著高于pcDNA 3.1组，细胞凋亡率显著低于pcDNA 3.1组（P ＜0.05）。见图3B、图3D，表4。

表4 过表达人类表皮生长因子受体2（HER2）对胃癌细胞凋亡的影响（n=9）/x ± s

2.5 敲减HER2 对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

与si-NC 组相比，si-HER2 组SGC-7901细胞中HER2 表达显著低于si-NC 组。si-HER2 组SGC-7901 细胞增殖活力（48、72 h 时）、迁移细胞数和侵袭细胞数显著低于si-NC 组，细胞凋亡率显著高于si-NC 组。与pcDNA 3.1 组相比，pcDNA 3.1-HER2 组SGC-7901 细胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表达均显著降低，MMP-9、MMP-2 蛋白表达均显著升高，与si-NC 组相比，si-HER2组细胞中p16、p21、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 蛋白表达均显著升高，MMP-9、MMP-2 蛋白表达均显著降低。见图4和表5，6。

3 讨论

HER2是位于染色体位置17q21的原癌基因，在上皮，间充质和神经起源的组织中编码185 kDa 的跨膜糖蛋白。HER2 属于受体酪氨酸激酶家族，其包含4 个成员：HER1（又称ERBB1），HER2（又称ERBB2），HER3（又 称ERBB3）和HER4（又 称ERBB4）。来自这些受体的信号转导由配体与受体细胞外结构域结合，然后受体二聚化和细胞质结构域内特定酪氨酸残基的反式自磷酸化引发。然而，HER2 是一种孤儿受体，并且始终处于活跃的构象。在HERs 中，HER2 是与其他HER 受体异二聚化的优选结合伴侣，并且在过表达时也是同二聚化的。HER2 的同源和异源二聚化导致几种信号传导途径的激活，包括磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）/蛋白激酶（AKT）和丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径以及许多其他关键信号传导元件，如信号转导与转录激活因子3（STAT3）和c-JUN。这些信号通路调节细胞分裂、增殖、存活、迁移、分化、凋亡等细胞运动。此外，据报道，HER2 的羧基末端部分（约90～100 kDA 称为p95HER2）在其切割后易位至细胞核，并作为核因子在某些基因的转录调控中相互作用。张婷等在胃癌的研究中早已报道，HER2 高表达与胃癌患者较低的分化程度有关。崔建新及有关研究报道，HER2 可调控曲妥珠单抗对胃癌患者的治疗效果，其在胃癌的诊断及靶向治疗中均具有重要意义。刘晓伟与张宏在胃癌的研究中发现，HER2 的表达水平与癌组织的分化具有紧密相关性，与患者的性别、年龄、肿瘤转移浸润程度无关。令人遗憾的是，HER2 在胃癌细胞中的表达及对胃癌细胞的细胞表型变化的影响并未进行深入的研究。本研究表明，胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、BGC-823 中HER2 在mRNA 和蛋白水平的表达均明显升高，这与胃癌癌组织中HER2 呈高表达相一致。本研究选择HER2 表达差异较大的SGC-7901 细胞进行体外研究，结果表明，过表达HER2 显著增加SGC-7901 细胞的增殖、迁移侵袭能力，并降低凋亡率，而敲减HER2 则可抑制SGC-7901 细胞的增殖、迁移侵袭并促进凋亡，这说明HER2 对胃癌细胞的恶性表型变化具有促进作用，这为探索HER2 在胃癌细胞中的功能机制提供充分的支持。深入研究发现，HER2 可调控胃癌细胞增殖相关蛋白p16、p21，迁移侵袭相关蛋白MMP-9、MMP-2 和凋亡相关蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表达，提示HER2 对胃癌细胞恶性生物学行为的调控机制可能与调控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表达相关。这为HER2在胃癌细胞中的作用机制研究提供参考。

表5 敲减人类表皮生长因子受体2（HER2）对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移侵袭及凋亡的影响（n=9）/x ± s

表6 人类表皮生长因子受体2（HER2）表达改变对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移侵袭及凋亡相关蛋白表达量的影响（n=9）/x ± s

综上所述，HER2 可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制凋亡，其作用机制与调控p16、p21、MMP-9、MMP-2、cleaved-PARP、cleaved caspase-3 的表达相关，为HER2 生物制剂在胃癌治疗中的应用提供支持。

（本文图3，4见插图2-2）