长链非编码RNA GAS5、微小RNA-21在多囊卵巢综合征中的表达及生物学意义

祁彦萍，王英，杨建敏

作者单位：南阳市中心医院妇产科，河南 南阳473000

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是临床常见的一种内分泌疾病，其主要临床表现为月经稀发、多囊卵巢，已经影响育龄妇女生活质量。目前PCOS 发病机制尚未阐明，既往研究报道显示PCOS 的发生过程涉及多种基因或信号通路。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）在PCOS 发生与发展过程中发挥重要调控作用，研究表明长链非编码RNA GAS5（LncRNA GAS5）在PCOS 病人中呈低表达，并可能促进PCOS发生及发展。但关于GAS5 在PCOS 发生过程中的调控机制尚未阐明。生物信息学分析显示微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）可能是GAS5 的靶基因，研究表明miR-21在PCOS病人中呈高表达，其表达量与病人肥胖程度有关。本研究首先检测PCOS 病人中GAS5与miR-21的表达水平，分析其与病人生化指标的相关性，通过原代培养卵巢颗粒细胞，探究GAS5 与miR-21 表达变化对细胞增殖及凋亡的影响，旨在为揭示PCOS 发病机制奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年4月至2018 年10 月于南阳市中心医院就诊的50 例PCOS 病人为观察组，年龄（28.46±5.49）岁，年龄范围为23～35 岁，所有病人均符合荷兰鹿特丹会议制定的PCOS 相关诊断标准中任意两项：无排卵或稀发排卵；单侧与双侧卵巢最大径处于2～9 mm 之间的卵泡数超过12 个；高雄激素血症。选取同时期本院收集的45 例非PCOS 病人为对照组，年龄（29.42±6.12）岁，年龄范围为25～36 岁。所有病人均未服用降脂等药物；未合并高血压、糖尿病等相关疾病。所有病人知情且签署同意书。两组病人年龄、不孕年限、体质量指数（BMI）等指标相比差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。两组临床资料见表1。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

1.2 材料与试剂

20只SD 雌性大鼠，清洁级，体质量范围为200～230 g，购自凯学生物（上海），动物许可证号SCXK（沪）：2016-0009。Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher；Trizol试剂购自美国Invitrogen；pcDNA3.1购自上海柯雷生物；anti-miR-21、antimiR-NC、miR-21 mimics、miR-NC、si-GAS5、si-NC 购自广州锐博生物；反转录试剂盒与实时荧光定量试剂盒均购自大连宝生物；CCK-8 购自弗元（上海）生物；细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝；兔抗鼠Bax、Bcl-2 抗体购自美国CST；山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷。

1.3 检测病人临床指标

所有病人均于月经期第2～5 天分别抽取空腹静脉血5 mL，室温条件下经3 000 r/min 转速离心30 min，吸取上清置于EP 管内，放入-80 ℃超低温冰箱保存。应用放射免疫法检测总睾酮（TT）、雄烯二酮含量。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清白细胞介素-18（IL-18）水平。

1.4 方法

1.4.1 原代培养卵巢颗粒细胞 大鼠经常规饲养2 d，将血清促性腺激素（40 IU）经皮下注射入小鼠体内，继续培养48 h，采用颈椎脱臼法处死小鼠，切除卵巢组织，使用生理盐水清洗，去除卵巢表面包膜及其周围脂肪组织，生理盐水清洗，将其置于不含血清的DMEM 培养基，使用注射针头刺破卵泡释放卵泡颗粒细胞，参照相关文献操作培养卵泡颗粒细胞，待细胞生长密度至80%左右时进行传代培养。

1.4.2 实验分组 取生长状态良好的卵泡颗粒细胞，分别将pcDNA、pcDNA-GAS5、anti-miR-NC、antimiR-21 转染至卵泡颗粒细胞，分别命名为pcDNA组、pcDNA-GAS5组、anti-miR-NC组、anti-miR-21组，将未经转染的卵泡颗粒细胞作为NC 组。转染过程参照Lipofectamine2000说明书进行操作。各组细胞转染后继续培养48 h，收集对数期细胞进行后续实验。

1.4.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测LncRNA GAS5、miR-21 的表达水平 采用Trizol 法提取血清中总RNA，应用分光光度计检测RNA浓度与纯度，按照反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，GAS5 以GAPDH 为内参，miR-21 以U6 为内参，置于ABI StepOneTM 实时荧光定量PCR 仪进行扩增。反应体系：qPCR Super Mix（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free 双蒸水补足体系至25 μL。反应条件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共循环40 次。采用2法计算LncRNA GAS5、miR-21的相对表达量。

1.4.4 CCK-8 检测细胞增殖 收集pcDNA 组、pcDNA-GAS5 组、anti-miR-NC 组、anti-miR-21 组、NC 组细胞接种于96 孔板（3×10个/孔），分别于培养24、48、72 h 时每孔分别加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃恒温培养箱内培养4 h，应用酶标仪检测各孔在450 nm波长时的吸光度值（OD）。

表1 多囊卵巢综合征（PCOS）50例与非PCOS 45例一般临床资料比较/x ± s

1.4.5

流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组卵巢颗粒细胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 转速离心6 min，弃上清，PBS 清洗，依次加入5 μL Annexin V-FITC 与5 μL PI，室 温 避 光 孵 育10 min，置 于FACS Calibur 流式细胞仪及应用Cellauest 软件检测各组细胞凋亡。

1.4.6

双荧光素酶报告基因检测LncRNA GAS5 的靶基因 starbase 预测显示LncRNA GAS5 与miR-21存在靶向关系，构建野生型载体WT-GAS5、突变型载体MUT-GAS5，分别将WT-GAS5、MUT-GAS5 与miR-NC、miR-21 mimics 共转染至卵巢颗粒细胞参照荧光素酶活性检测试剂盒分别检测各组细胞荧光素酶活性。

1.4.7

蛋白质印迹法（Western Blot）检测Bax、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表达 提取各组卵巢颗粒细胞总蛋白，取50 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜，封闭，分别加入一抗稀释液（1∶1 000）与二抗稀释液（1∶2 000），TBST 洗涤，曝光，显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以x ± s 表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组之间两两比较采用SNK-q 检验的方法；采用Pearson法分析多囊卵巢综合征病人中LncRNA GAS5 与miR-21 表达的相关性，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床指标比较

与对照组相比，观察组TT、雄烯二酮、IL-18水平明显升高（P ＜0.05），见表2。

表2 多囊卵巢综合征（PCOS）50例与非PCOS 45例临床指标比较/x ± s

2.2 LncRNA GAS5、miR

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21 在多囊卵巢综合征病人中的表达及其相关性分析

qRT-PCR 检测结果显示，观察组病人血清中GAS5 的表达水平明显低于对照组（P ＜0.05），miR-21 的表达水平明显高于对照组（P ＜0.05），见表3。采用Pearson法分析多囊卵巢综合征病人中GAS5 与miR-21 的相关性，结果显 示GAS5 与miR-21 呈 负 相 关（r =-0.310，P =0.028），见图1，表3。

表3 LncRNA GAS5、miR-21在多囊卵巢综合征病人中的表达/x ± s

图1 多囊卵巢综合征病人中长链非编码RNA（LncRNA）GAS5与微小RNA-21（miR-21）的相关性分析

2.3 LncRNA GAS5、miR

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21 表达与多囊卵巢综合征病人临床指标的相关性分析

采用Pearson 法分析多囊卵巢综合征病人临床指标与GAS5、miR-21的相关性，结果显示，GAS5 与TT、IL-18 呈负相关（P ＜0.05），miR-21 与TT、雄烯二酮、IL-18 呈正相关（P ＜0.05），见表4。

表4 LncRNA GAS5、miR-21表达与多囊卵巢综合征病人临床指标的相关性分析

2.4 GAS5过表达对卵巢颗粒细胞增殖及凋亡的影响

实验结果显示，与pcDNA 组相比，pcDNA-GAS5组细胞活力显著降低（P ＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P ＜0.05），Bax 蛋白相对表达量显著升高（P ＜0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量显著降低（P ＜0.05），见表5。

2.5 GAS5靶向调控miR-21的表达

starBase 预测显示GAS5 与miR-21 存在结合位点，见图2。miR-21 过表达可降低WT-GAS5 的荧光素酶活性（P ＜0.05），而对MUT-GAS5 的荧光素酶活性无明显影响，见表6。GAS5 可负向调控miR-21 的表达（P ＜0.05），见表7。

表5 GAS5过表达对卵巢颗粒细胞增殖及凋亡的影响（n=9）/x ± s

图2 GAS5与miR-21存在结合位点

表6 双荧光素酶报告实验（n=9）/x ± s

表7 GAS5调控miR-21的表达（n=9）/x ± s

3 讨论

LncRNA 在PCOS 病人中表达异常并可能参与PCOS 发生及发展过程。但仍有部分LncRNA 在PCOS 发生过程中的作用机制尚未可知。miRNA 可通过抑制靶基因表达从而参与PCOS 发生及发展过程。

GAS5 过表达可明显降低心肌成纤维细胞增殖活力。本研究结果显示GAS5 在PCOS 病人血清中表达下调，进一步研究显示GAS5 与FSI、TT、IL-18、HOMA-IR呈负相关，提示GAS5表达量降低可能参与PCOS 发生与发展过程。研究表明卵巢颗粒细胞异常增殖是促进PCOS 发生的重要原因。本研究结果显示GAS5 过表达后可显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低，提示GAS5 过表达可能通过调控线粒体途径抑制细胞凋亡。

miR-21 在PCOS 病人中表达上调，并可作为诊断PCOS 的分子标志物。miR-21 表达量升高可能促进PCOS 的高雄激素状态的发生。与上述研究报道结果相似，本研究结果显示PCOS 病人血清中miR-21的表达水平明显升高，其高表达量与病人FBS、TT、雄烯二酮、IL-18、HOMA-IR 呈正相关，提示随着miR-21 表达量的升高，PCOS 病人疾病严重程度越严重。同时本研究结果显示PCOS 病人中GAS5 与miR-21 的表达量呈负相关，进一步通过荧光素酶报告实验结果证实GAS5 可靶向结合miR-21，并可负向调控miR-21 的表达水平。提示GAS5过表达可能通过下调miR-21 表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，抑制细胞增殖。

综上所述，GAS5 表达量降低与miR-21 表达量升高可能参与PCOS 发生及发展过程，可能作为临床诊断PCOS 的重要指标，GAS5 过表达可能通过抑制miR-21 表达降低卵巢颗粒细胞增殖能力及诱导细胞凋亡，可为PCOS分子靶向治疗提供理论依据。