高效液相色谱法测定不同时间人血浆中帕拉米韦的浓度及临床观察

赵晓娟，赵永红，王淑梅，李浩然，刘秀菊

作者单位：河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄050000

流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。在全球范围内，估计每年有5%～10%的成人及20%～30%2岁以上儿童受到影响，大约每年有2.5～5 万人死于流感。流感病毒属于正粘病毒科，为RNA 病毒。根据核蛋白和基质蛋白分为甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2 亚型及乙型流感病毒中的Victoria 和Yamagata系。

抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂对甲型、乙型流感均有效。我国推荐使用的神经氨酸酶抑制剂有磷酸奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦。帕拉米韦是第一个注射用的神经氨酸酶抑制剂，为恶心、呕吐、吞咽困难、昏迷等一些重症病人及老人和儿童提供了一种新的给药途径。帕拉米韦常见的不良反应有消化系统症状和实验室检测值异常，偶见心血管和神经系统反应。消化系统反应常见腹泻、恶心、呕吐、胃疼等；临床检验值异常主要表现为血中网织红细胞降低、白细胞计数降低、中性粒细胞比降低、淋巴细胞比升高和甘油三酯升高等。至今为止，国内关于应用HPLC 法测定帕拉米韦在人体血浆中不同时间药物浓度的文献报道较少，但此类文献可见报道。而本研究通过测定帕拉米韦给药后不同时间人血浆药物浓度，为建立群体药代动力学模型提供基础研究，为临床安全合理用药提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱系统包括Empower Application 操作平台，486 紫外检测器和515 泵（美国Waters公司）。

帕拉米韦对照品（上海麦克林生化科技有限公司，含量98.369%，批号：C10075504）；甲硝唑（内标）对照品（中国食品药品检定研究院，含量99.9%，批号：100191-201507）；乙腈为色谱纯；三乙胺、甲酸、磷酸、磷酸二氢钾均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Diamonsil C柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相（水相：有机相=86：14，V/V）水相：5 mmol/L 磷酸二氢钾溶液（0.1%三乙胺），磷酸调pH 5.0，有机相：乙腈；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的配制

帕拉米韦储备液：精密称取帕拉米韦对照品10 mg，置10 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，制成浓度为1 mg/mL的储备液，4 ℃保存待用。

帕拉米韦对照品溶液：取帕拉米韦储备液适量，分别制备浓度为500、200、100、50、20 和10 μg/mL的帕拉米韦对照品溶液，4 ℃保存待用。

内标溶液：精密称取甲硝唑对照品10 mg，置100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，制成浓度为0.1 mg/mL的储备液，4 ℃保存待用。

2.3 血样预处理

取人血浆样品200 μL，置1.5 mL离心管中，加入20 μL 内标溶液，涡旋混合30 s，加入乙腈（含0.1%甲酸）800 μL，涡旋混合1 min，离心（6 163×g）5 min，取上清液500 μL，置1.5 mL离心管中，40 ℃水浴氮气流吹干，剩余物以流动相100 μL复溶，涡旋混合1 min，离心（6 163×g）5 min，取上清液。

2.4 方法学

2.4.1 专属性 分别将帕拉米韦对照品溶液、内标溶液直接进样；空白人血浆（不加内标）、给药后15 min 人血浆按“2.3”项下方法处理后进样，记录色谱图。可见人血浆中内源性物质与帕拉米韦及内标在该色谱条件下分离良好，不干扰测定。见图1。

2.4.2 线性试验与最低定量限 分别取帕拉米韦对照品溶液各20 μL，置1.5 mL塑料离心管中，分别加入空白人血浆180 μL，制得浓度为50、20、10、5、2、1 μg/mL的模拟血浆样品，均按“2.3”项下方法处理并进样测定，以血浆中帕拉米韦的浓度c为横坐标，以帕拉米韦峰面积比内标峰面积的比值R为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程R=0.032 1c+0.015 7（r=0.999 9）。帕拉米韦在1～50 μg/mL范围内线性关系良好，最低定量限（LLOQ）为1 μg/mL。

图1 HPLC色谱图：A为帕拉米韦对照品溶液；B为内标溶液；C为空白人血浆；D为给药15min后人血浆；E为模拟血样（空白血人浆、帕拉米韦对照品、内标）

2.4.3 回收率试验 按“2.4.2”项下方法制备低、中、高及最低定量限浓度（2，10，40，1 μg/mL）的模拟血样各5 份，按“2.3”项下方法处理并进行测定，记录峰面积。根据标准曲线方程计算实测浓度，与理论浓度之比计算方法回收率。另外，各样品分别于1 d 和连续5 d 测定，计算日内和日间精密度。结果见表1。

表1 不同浓度帕拉米韦回收率和精密度实验结果/%

2.4.4 稳定性试验 分别考察帕拉米韦模拟血样（2，40 μg/mL）-70 ℃保存5 d、反复冻融3 次及处理后室温放置4 h 的稳定性，RSD 分别为7.7%、8.4%、5.2%和8.9%、9.2%、7.4%，表明帕拉米韦在上述条件下稳定性良好。

2.5 样本测定

2.5.1 样本采集 经医院伦理委员会批准，选择5例单纯性流感病人，有流感症状且所有症状不超过48 h，发热始于48 h 之内，流感病毒快速抗原检测（RAT）阳性，并签署知情同意书的临床病人。病人年龄32.8 岁，年龄范围为18～50 岁，男2 例，女3 例，体质量指数（BMI）范围为18～24 kg/m。单次静脉滴注帕拉米韦氯化钠注射液300 mg（100 mL），滴注时间不少于30 min，于给药前及给药后15 min，45 min，3 h 由肘静脉取血，大约3 mL。全血在采集后1 h 内，3 000 r/min 离心10 min，分离血浆，于-70 ℃冰箱保存待测。

2.5.2 样本测定结果 取5例病人的待测血浆样品自然解冻，按“2.3”项下方法处理并进样测定，根据标准曲线计算帕拉米韦的血药浓度，结果显示，全部样本均可检出。见表2。

2.6 临床观察

2.6.1 临床疗效 观察并随访5例病人使用帕拉米韦氯化钠注射液后的发热及流感症状缓解时间，结果见表3。

表2 单纯性流感5例不同给药时间的血浆中帕拉米韦浓度/（μg/mL）

表3 单纯性流感5例发热及流感症状缓解时间/h

2.6.2 不良反应 在观察并随访5 例病人的过程中，3 号病人在给药结束后0.5 h 发生胃痛，约2 h 后缓解，严重程度为轻度，可能与使用药物有关。

3 讨论

本研究首先采用流动相5 mmol/L 的磷酸二氢钾∶乙腈比例86∶14，流速0.8 mL/min，结果显示在此比例下，帕拉米韦与内标能达基线分离，且血浆中杂质对内标也无干扰，后调流速0.8 mL/min 为1 mL/min，血浆中杂质对帕拉米韦和内标均无干扰，且其保留时间更短，出峰更快，可缩短分析的时间。本研究在建立方法学的基础上进一步应用于临床血浆样本的测定，与使用液质方法相比，成本更低，更适用于临床快速分析。

本研究选取了5 例流感临床病人，对5 例病人帕拉米韦给药后不同时间的血浆药物浓度做了初步的测定，均可检出。从结果来看，药物在体内的血药浓度与不良反应的发生没有直接的关系，可能与用药的不同个体有关。在本次研究的基础上，可以通过建立群体药代动力学模型，实现临床对病人（不同年龄、体重、肾脏功能）的个体化用药，减少药物不良反应的发生。帕拉米韦在短时间内能有效缓解病人流感症状，虽然样本量少，但也观察到了病人不良反应的发生。因此，为了保障病人的用药安全，在临床应用帕拉米韦的过程中还是要注意其不良反应的发生，对病人进行不良反应的监护。但由于本研究纳入例数有限，对于不良反应的监护需要更进一步扩大样本量进行统计分析。