丁基苯酞调控沉默信息调节因子1/核因子相关因子2通路抑制缺血性脑卒中大鼠氧化应激损伤的实验研究

王静怡，高娟娟，王彤歌

作者单位：1汉中市人民医院神经内科，陕西 汉中723000；

2暨南大学附属第一医院神经内科，广东 广州510632

缺血性脑卒中属于临床常见的一类缺血性脑血管病，发病率、致残率和致死率均较高。据统计，我国急性缺血性脑卒中年标准化患病率约为1 114.8/10 万，病死率约为114.8/10 万，且目前该病的患病率与病死率仍呈逐年增长趋势。对于缺血性脑卒中病人，目前临床医师多主张在时间窗内给予血管再通治疗，包括溶栓、机械取栓等，并配合给予抗凝、降低颅内压、营养脑神经等支持治疗，可减轻脑组织损伤，改善预后，但仍有部分病例遗留有不同程度的偏瘫、认知障碍、失语、吞咽功能障碍等，且死亡率仍需进一步控制。氧化应激反应是缺血性脑卒中研究的热点，也是该病发生和发展的重要机制，以往报道显示缺血性脑卒中脑组织氧化应激反应损伤受沉默信息调节因子1（SIRT1）/核因子相关因子2（Nrf2）通路调控，可作为治疗的作用靶点。研究指出，在缺血性脑卒中发病后由于局部缺血缺氧可损伤神经元所支配的机体功能。丁基苯酞是从芹菜油中提取的化学成分之一，可治疗高血压，且具有神经保护作用，且在既往报道中证实该药物具有抗老年小鼠脑组织氧化能力，但是该药物是否能够调控SIRT1/Nrf2通路控制缺血性脑卒中病人的氧化应激损伤尚鲜有报道。鉴于此，本研究自2018 年3 月至2019 年3 月选取50 只成年雄性SD大鼠设计如下对照实验，旨在深入探讨上述问题，挖掘丁基苯酞的临床价值。

1 材料与方法

1.1 动物

50 只成年雄性SD 大鼠，均健康，7～9 周龄，体质量（220±20）g，SPF 级，购自河南省实验动物中心，合格证号SCXK（豫）20180005。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.2 试剂及设备

丁基苯酞（购自成都市科龙化工试剂厂，纯度≥98%）；无菌生理盐水（购自杭州四季青生物有限公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（购自北京百奥莱博科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）检测试剂盒（购自艾美捷科技有限公司）；细胞裂解液（购自上海生物工程技术公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液（购自北京雷根生物技术有限公司）；二奎啉甲酸法（BCA）蛋白定量试剂盒（购自美国Hyclone Pierce 公司）；病毒核酸提取法（Trizol）试剂盒（购自美国Invitrogen 公司）；兔抗鼠沉默信息调节因子1（SIRT1）、核因子相关因子2（Nrf2）单克隆抗体（一抗，放大倍数：1∶1 000），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔SIRT1、Nrf2 多克隆抗体（二抗，放大倍数：1∶5 000）（购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司）。

XSZ-H 型光学显微镜（购自重庆光学仪器厂）；L500 型台式离心机（购自上海沪粤明科学仪器有限公司）；NVSLM1 型组织切片机（购自美国WPI 公司）；680型酶标仪（购自美国Bio-Rad公司）；722N型分光光度计（购自河南兄弟仪器设备有限公司）；7300 型聚合酶链反应（PCR）仪（购自美国ABI 公司）；PowerPro3AMP型电泳仪（购自通用实验科技有限公司）。

1.3 方法

分组、建模及干预方法：50 只成年雄性SD大鼠被采用随机数字表法分为假手术组、模型组和低、中、高剂量组，各10 只。建模方法：腹腔注射350 mg/kg 水合氯醛（10%），仰卧位固定，做颈部正中切口，依次游离左侧颈总动脉、颈内外动脉，电凝颈内外动脉的交通支，结扎远心端。在结扎部位下端剪一个小口穿入尼龙线，经颈内动脉进入，直至大脑中动脉起始部，长度约为18.5 cm。建模大鼠苏醒后若出现Horner 征则认为建模成功。假手术组同上做切口、游离，无尼龙线结扎操作。建模成功后低、中、高剂量组分别给予40、80、160 mg/kg 丁基苯酞腹腔注射，余两组均给予等量生理盐水腹腔注射，1次/24小时，持续72 h。

神经功能缺损评价：采用Zea Longa 标准评价，共4分，评分越高表示神经功能缺损越严重。

脑皮质组织病理改变观察：采用HE 染色。给药结束后深度麻醉，多聚甲醛活体灌注，断头取脑，取缺血侧脑皮质组织Barrel 脑区常规以4%多聚甲醛固定，包埋、切片、HE染色、光学显微镜观察。

缺血侧脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX 的活性检测：采用化学比色法。取脑皮质组织，与预冷的生理盐水一同匀浆，生理盐水体积总量是组织块的9 倍，充分匀浆化，3 600 r/min 离心15 min，留取上清，按照试剂盒说明书操作，并以酶标仪测定470 nm 处波长的光密度，绘制标准曲线，测定上述蛋白活性。

缺血侧脑皮质组织SIRT1、Nrf2 mRNA 表达检测：采用实时PCR（qRT-PCR）检测。常规取脑皮质组织匀浆后以Trizol 试剂盒采用一步法提取总RNA，分光光度计检测，并逆转录为cDNA。参照基因库信息设计SIRT1、Nrf2、β-actin（内参）上下游引物序列，并委托宝生物（大连）科技有限公司合成。长度均为20 bp。配置反应体系，PCR 扩增，条件：94 ℃30 s，30 个循环：54 ℃30 s，72 ℃45 s，60 ℃90 s，最后72 ℃5 min。室温冷却，电泳并对产物进行扫描，计算目的基因的相对表达量，即2。

缺血侧脑皮质组织SIRT1、Nrf2 蛋白表达检测：采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测。常规取脑皮质组织匀浆、裂解、蛋白定量。加入上样缓冲液，加热变性处理，电泳，转膜，以脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗室温孵育，过夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，显影成像，用Image-Pro Plus 软件扫描图像的目的条带，分析其灰度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以x ± s描述，多样本间比较以单因素方差分析，其中的每两样本间比较以SNK-q检验，组内治疗前后比较以配对t 检验；若计量资料不符合正态分布或方差不齐，则采用秩和检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评价比较

建模和给药期间模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组分别有3只、3 只、2 只、1 只死亡，剔除。给药前后与假手术组比较，其余4 组神经功能缺损评分均升高（P ＜0.05），且给药前模型组、3 剂量组中每两组比较均差异无统计学意义（P ＞0.05）；给药后模型组评分明显高于给药前（P ＜0.05），3 剂量组评分均明显降低（P ＜0.05）；给药后3 剂量组评分均低于模型组（P ＜0.05），中剂量组和高剂量组评分均低于低剂量组（P ＜0.05），高剂量组评分低于中剂量组（P ＜0.05），见表1。

2.2 各组脑组织病理学观察

假手术组脑皮质神经元饱满、结构正常、核大且圆，常染色质均匀分布，膜结构清晰，核糖体丰富；模型组脑皮质神经组织结构坏死、溶解，细胞膜/核膜断裂，神经元崩解，结构不清，细胞核皱缩；低剂量组脑皮质神经组织部分结构坏死、溶解，部分细胞膜/核膜断裂，核尚完整，膜结构不清，残存的线粒体嵴断裂空泡化；中剂量组脑皮质神经组织结构轻度溶解，核不规则，核仁明显偏向一侧，可见明显核袋，染色质较密集，膜结构不清晰，细胞质致密，少部分线粒体嵴断裂；高剂量组脑皮质神经组织基本正常，多数神经元细胞规则，核大，仍有部分神经元核仁偏位，可见少量异染色质，常染色质较均匀，膜结构相对清晰，极少量线粒体仍可见嵴断裂。见图1。

表1 缺血性脑卒中大鼠各组神经功能缺损评分比较/（分，±s）

2.3 各组脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX 的活性比较

各组脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX 的活性比较均差异有统计学意义（P ＜0.05），与假手术组比较，其余4组MDA的活性均升高（P ＜0.05），SOD、GSH-PX 的活性均降低（P ＜0.05）；与模型组比较，3剂量组MDA 的活性均降低（P ＜0.05），SOD、GSHPX的活性均升高（P ＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和中剂量组MDA 的活性均降低（P ＜0.05），SOD、GSH-PX的活性均升高（P ＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组MDA 的活性降低（P ＜0.05），SOD、GSH-PX的活性均升高（P ＜0.05），见表2。

表2 缺血性脑卒中大鼠各组脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX的活性比较/±s

2.4 各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 mRNA 表达比较

各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 mRNA 表达比较均差异有统计学意义（P ＜0.05），与假手术组比较，其余4组SIRT1、Nrf2 mRNA 表达均下降（P ＜0.05）；与模型组比较，3 剂量组SIRT1、Nrf2 mRNA 表达均升高（P ＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组SIRT1、Nrf2 mRNA 表达均升高（P ＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组SIRT1、Nrf2 mRNA 表达均升高（P ＜0.05），见表3。

表3 缺血性脑卒中大鼠各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 mRNA表达比较/±s

2.5 各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 蛋白表达比较

各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 蛋白表达比较均差异有统计学意义（P ＜0.05），与假手术组比较，其余4组SIRT1、Nrf2 蛋白表达均下降（P ＜0.05）；与模型组比较，3 剂量组SIRT1、Nrf2 蛋白表达均升高（P ＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组SIRT1、Nrf2 蛋白表达均升高（P ＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组SIRT1、Nrf2 蛋白表达均升高（P ＜0.05），见表4，图2。

表4 缺血性脑卒中大鼠各组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 蛋白表达比较/±s

图2 脑皮质组织沉默信息调节因子1（SIRT1）、核因子相关因子2（Nrf2）蛋白蛋白质印迹法（Western Blot）检测

3 讨论

氧化应激是缺血性脑卒中病人局部脑组织损伤的主要作用因素，从动脉粥样硬化启动的中心环节，即低密度脂蛋白氧化成为氧化型低密度脂蛋白便发挥着重要的作用，直至脑卒中发生后基质金属蛋白酶被激活、血脑屏障被破坏、神经元变性凋亡等过程，氧化应激均是其中重要的机制。有研究指出，在缺血性脑卒中病人中由于氧化应激反应的存在不仅可影响神经元的恢复，还可影响预后，危害极大。国外报道表明，氧化应激在动脉粥样硬化斑块形成、缺血性脑卒中和脑损伤后侧支循环建立等代偿机制中均有参与，而抗氧化应激已成为缺血性脑卒中临床防治的重点。但目前临床常用的药物抗氧化应激作用均不甚理想，而丁基苯酞在缺血性脑卒中治疗中显示出良好的价值，故本研究特尝试探讨该药物是否对缺血性脑卒中有抗氧化应激作用，并初步探讨其机制。

本研究结果显示，给药后3 剂量组神经功能缺损评分均下降，模型组则升高，且3剂量组的作用效果呈剂量依赖性，可知丁基苯酞有助于减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损程度，且高剂量丁基苯酞的效果最佳。在脑组织病理学观察结果中显示，假手术组均正常，模型组呈严重病理改变，3 剂量组病理改变均有所减轻，且高剂量组与假手术组最为接近，提示丁基苯酞有助于减轻缺血性脑卒中大鼠脑皮质病理改变，且高剂量药物的效果最佳。丁基苯酞是中国医学科学院药物研究所研制的一种抗脑缺血药物，可通过改善缺血脑能量代谢、缩小脑梗死面积、减轻神经功能缺损发挥治疗作用。此外，丁基苯酞还可减轻局部脑缺血所致的脑水肿，促进脑血流恢复，改善软脑膜微循环，减轻卒中发生后的神经病理症状。本研究结果中，3 剂量组脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX 的活性均较模型组显著改善，且高剂量组均接近假手术组，可知丁基苯酞的应用有助于改善脑皮质组织的氧化应激反应。MDA 是在自由基作用下不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量可反映机体脂质过氧化程度，还可据此了解细胞损伤程度。SOD和GSH-PX 则是内源性抗氧化酶，可清除自由基，保证细胞免受损伤，其活力可反应机体对氧自由基的清除能力。在缺血性脑卒中发生后MDA 的活性显著增强，而SOD 和GSH-PX 的活性则显著降低，导致线粒体自身结构与功能受到严重损伤，诱发脑组织损伤和神经功能缺损。有研究显示，左旋丁基苯酞可改善血管性痴呆大鼠模型的神经功能，减轻线粒体氧化应激水平，与本研究结果相符，表明丁基苯酞很可能具有抗氧化应激作用。结合上述分析，推测该药物可能是通过改善局部能量代谢和微循环等途径间接减轻氧化应激反应的。

此外，本研究中3 剂量组脑皮质组织SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表达均明显低于假手术组，均明显高于模型组，且3 剂量组中高剂量组SIRT1、Nrf2 mRNA及蛋白表达最高，中剂量组次之，低剂量组最低，表明丁基苯酞在缺血性脑卒中大鼠中应用有助于上调SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表达，且高剂量丁基苯酞的作用最强。SIRT1 是一种与细胞分化、衰老、凋亡以及能量代谢等密切相关的组蛋白去乙酰化酶，具有氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性，在脑组织、心脏组织中分布较多，在缺血性脑卒中发生后其表达水平下降，机体抗氧化应激损伤作用较弱，脑皮质组织线粒体氧化应激反应强烈，诱导神经功能缺损。Nrf2在外来刺激作用下可阻遏蛋白Keap1 解离，还可结合抗氧化反应元件启动多种抗氧化蛋白类基因的表达，达到控制氧化应激损伤的目的。在缺血性脑卒中发生后，Nrf2 表达下降，提示脑组织的抗氧化能力减弱，可进一步导致自由基代谢失去平衡，引发脑组织损伤和神经功能缺损，与此同时SOD、GSH-PX 的活性，而MDA 活性增强。因此在缺血性脑卒中治疗时可通过调控SIRT1/Nrf2通路上调二者的基因与蛋白表达改善MDA、SOD、GSH-PX 的活性，增强机体抗氧化能力，减轻氧化应激反应所致的脑组织损伤。 本研究对缺血性脑卒中大鼠模型基于丁基苯酞后发现SIRT1、Nrf2 mRNA及蛋白表达相较于假手术组均明显降低，而相较于模型组均明显升高，可知丁基苯酞可能上调SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白表达从而发挥抗氧化应激作用的，且其作用呈剂量依赖性。

综上所述，丁基苯酞可改善缺血性脑卒中大鼠模型的神经功能，减轻脑皮质组织病理改变，调节脑皮质组织MDA、SOD、GSH-PX 等氧化应激反应指标的活性，推测是通过调控SIRT1/Nrf2 通路上调SIRT1、Nrf2 mRNA 及蛋白的表达实现的，且呈剂量依赖性。本研究显示丁基苯酞具有抗缺血性脑卒中氧化应激反应的作用，并初步探讨了其作用机制，为其推广应用奠定了基础，但氧化应激反应是复杂的生理病理过程，该药物抗氧化应激反应是否具有其它作用机制仍需深入探讨。

（本文图1见插图2-1）