杭州市5 279例新生儿耳聋基因突变筛查及突变携带者随访结果分析

梅瑾 王敏 王昊 何茶英 连结静 傅婷婷 胡文胜

先天性耳聋是人类发病率较高的出生缺陷之一，尤其是在新生儿中多发。统计数据显示该疾病在新生儿中的发病率为0.1%，其中一半的患儿与遗传缺陷有关[1]。目前已知的耳聋相关并且已经作为临床筛查目标的基因有GJB2、SCL26A4、GJB3、线粒体12SrRNA[2-3]。2012年北京市政府开展新生儿耳聋基因筛查民生项目，随后成都、长治、南通、郑州等城市也开展了新生儿遗传性耳聋基因筛查工作[4-8]，促进了先天性耳聋的早发现、早诊断、早干预等防治工作。然而，杭州地区新生儿耳聋基因筛查项目开展较迟，有关耳聋基因的突变率等基础数据及相关研究报道较少。为此，本研究采集2018 年6 月至2019 年12 月在杭州市妇产科医院出生的5 279 例新生儿足底血，提取DNA 并应用微阵列芯片杂交法检测4 个耳聋基因15 个位点，分析基因突变携带率和突变类型，结合新生儿听力筛查结果，比较两者相关性，对听力筛查未通过的耳聋基因突变者进行耳聋全基因测序诊断确定基因型，随访其听力发育和干预情况，以评估听力-耳聋基因联合筛查在先天性耳聋早期诊断与干预中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年6 月至2019 年12 月本院出生的新生儿5 279 例，男婴2 797 例，女婴2 482 例；出生孕周37～41（39.03±0.97）周；体重2 500～4 100（3 300±50）g；新生儿父母均来自杭州辖区的11 个区、县（市）。排除重度窒息、重度黄疸、明显先天缺陷及出生后转新生儿病房治疗的患儿。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有患儿监护人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 新生儿足底血采集 由儿保科专业人员在新生儿出生72 h 内，在监护人知情同意并签字下，按照《新生儿疾病筛查技术规范（2010 版）》和采血常规的要求，采集新生儿足底血，使用专用采血滤纸片制成2 个直径≥8 mm 的血斑，充分渗透，自然晾干，独立装袋，送至实验室进行耳聋基因检测。

1.2.2 常见耳聋基因突变筛查 采用打孔器得到3 mm直径的干血斑，使用十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（成都博奥晶芯生物科技有限公司，国械注准20173401343）进行检测。按试剂盒说明要求，使用核酸提取试剂盒提取新生儿干血斑中的DNA，与空白样本、阴性对照及阳性对照一起进行PCR 扩增。扩增完成后，使用微阵列芯片杂交法对标本进行4 个基因15 个位点的检测[GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT），GJB3（c.538C＞T），SLC26A4（c.2168A＞G、c.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.IVS15+5G＞A）和线粒体12SrRNA（m.1494C＞T、m.1555A＞G）]。对基因芯片筛查中出现突变位点的样本使用Sanger 测序法进行验证[3]。采血后2 周内报告结果。筛查结果分为未突变、杂合突变、纯合突变、复合杂合突变以及复合突变[9]。未突变为检测结果中未发现与耳聋相关的基因突变或基因型，杂合突变为同一基因里发现一种突变型，纯合突变为同一基因里发现两种一样的突变型，复合杂合突变为同一基因里发现两种不同突变型，复合突变为不同基因里各有一种突变型。对于线粒体12SrRNA 上同时出现的两种突变，定义为线粒体异质突变；线粒体12SrRNA 上仅一种突变，定义为线粒体均质突变。

1.2.3 听力筛查 由儿保科专业人员采用“两阶段筛查法”，即初筛和复筛，将结果录入医院产时信息系统，本研究数据从产时信息系统中提取。严格按照国家卫健委新生儿听力筛查规范要求进行，初次诊断性听力评估在3 个月内完成。初筛是在新生儿出生后满48～72 h 使用畸变产物耳声发射法（DPOAE）（德国麦科听力仪器公司，MAICO Diagnostic GmbH ERO-SCAN 型）进行听力测试，如果新生儿单耳或双耳没有通过测试，则记录为“未通过”。初筛未通过者产后42 d 至儿童保健门诊应用自动判别听性脑干诱发电位检查法（AABR）（德国麦科听力仪器公司，型号：MAICO Diagnostic GmbH MB11 型）复筛，若初筛和复筛两次均未通过测试，列为耳聋高危人群。结合耳聋基因筛查与诊断情况，3 个月内转听力诊断部门综合评估听觉能力，包括听性脑干反应（ABR）、声导抗检查及外耳道检查等。

1.2.4 耳聋基因诊断与父母基因筛查验证 耳聋基因筛查结果由产前诊断中心办公室专人管理，对新生儿耳聋基因突变携带者，电话通知其家长到本院遗传咨询门诊接受遗传咨询和健康教育，在知情同意的情况下，对耳聋基因突变新生儿父母行耳聋基因筛查验证，评估遗传因素的作用，对GJB2 和SLC26A4 耳聋基因突变者行基因测序诊断以确定基因型。

1.2.5 随访内容 产前诊断中心办公室专人随访耳聋基因突变和听力筛查未通过新生儿出生3 个月后听力诊断性检查情况以及耳聋者的个性化干预措施落实情况（配戴助听器或安装人工耳蜗）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耳聋基因突变情况 5 279 例耳聋基因突变筛查新生儿中，未突变4 999 例，突变280 例，其中杂合突变277 例，纯合和复合杂合突变3 例，突变率为5.30%（280/5 279）。4 个耳聋基因中，GJB2 突变率最高，为3.05%（161/5 279），其中纯合和复合杂合突变3 例，突变率为0.06%（3/5 279），杂合突变158 例，突变率为2.99%（158/5 279）；其余由高到低分别为SLC26A4 杂合突变84 例，突变率为1.59%（84/5 279）；GJB3 杂合突变18 例，突变率为0.34%（18/5 279）；线粒体12SrRNA 均质突变14 例，突变率为0.27%（14/5 279）；双基因杂合突变3 例，突变率为0.06%（3/5 297）。GJB2 基因突变中c.235delC 位点突变最多，达131 例，突变率为2.48%（131/5297）；SLC26A4基因中c.919-2A＞G 位点突变最多，为59 例，突变率为1.12%，见表1。

2.2 耳聋基因突变者基因诊断及父母验证情况 280例耳聋基因突变的新生儿父母均接受遗传咨询和健康教育，其中150 例新生儿父母依从性较好，在知情同意下，选择了耳聋基因突变筛查验证，结果135 例新生儿突变来源于无表型的父母一方，占90.0%。对2 例GJB2基因c.235delC 纯合突变和1 例GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 复合杂合突变新生儿进行GJB2 基因测序诊断，结果与筛查一致，见表1。另有19 例GJB2 和SLC26A4耳聋基因杂合突变新生儿进行基因测序诊断，发现其中4 例为GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变，父母经验证为相应位点突变的携带者。

表1 280 例新生儿4 个常见耳聋基因突变筛查、基因诊断及父母验证情况

2.3 耳聋基因筛查与听力筛查比较 5 279 例耳聋基因突变筛查新生儿中，耳聋基因未突变者听力筛查未通过率为0.05%（25/4 999），低于耳聋基因突变携带者的1.79%（5/280），差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 5 279 例新生儿耳聋基因筛查与听力筛查比较（例）

2.4 耳聋基因突变者听力诊断和干预随访情况 随访耳聋基因杂合突变新生儿277 例，其中2 例听力筛查未通过，经GJB2 全基因测序，1 例为GJB2 基因c.235delC位点杂合突变，听力诊断正常；另1 例为GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变，出生3 个月经听力诊断性检查，确诊中度耳聋，准备安装人工耳蜗；还对3 例听力筛查通过而基因测序诊断为GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变新生儿进行随访，出生3 个月听力均诊断正常。随访GJB2 基因纯合/复合杂合突变新生儿3 例，听力筛查双耳均未通过，基因测序基因型与筛查一致；其中GJB2 基因c.235delC纯合突变2 例，出生2 个月确诊为重度耳聋，出生6 个月准备安装人工耳蜗；GJB2 基因c.235delC/c.299delAT复合杂合突变1 例，出生2 个月确诊为中度耳聋，准备配戴助听器。另对14 例线粒体12SrRNA 突变携带者父母发放生活和用药指导卡片，对18 例GJB3 基因突变携带者和3 例双基因杂合突变者嘱其父母注意听力发育及生活指导。

3 讨论

听力障碍会直接影响患儿的语言发育，如果未早期发现，最终由聋致哑，给患儿的生长发育及社会生活带来非常严重的影响，为此，应尽早发现和干预患儿，避免其因错过最佳治疗期而成为永久性聋儿，这一直是临床工作者关注的重点。我国20 多年前就开展了新生儿耳声发射结合听性脑干听觉诱发电位测试（金标准）[10]听力筛查工作，该检测无创，假阳性率低，为发现新生聋儿起到了巨大的作用。但并不是所有的听力损伤都会在出生不久便发生，迟发性、渐进性甚至药物性耳聋都无法用该法查出。随着对耳聋基因的深入研究，已表明我国大部分先天性遗传性耳聋由为数不多的几个基因突变引起[11]，耳聋基因检测已经成为防控遗传性聋儿的重要措施[12-13]，在一定程度上弥补了听力筛查的不足[2]。

本研究在5 279 例新生儿中检出基因突变280 例，突变率为5.30%，与Zhang 等[14]报道的天津地区耳聋基因突变携带率为5.52%接近，比Chen 等[15]对我国18 篇新生儿耳聋基因筛查的文献进行Meta 分析，发现新生儿耳聋基因阳性检出率为4.7%略高，也高于阮宇等[16]4.51%和王川等[17]4.38%的报道，原因可能是我国不同地区新生儿耳聋基因筛查方式存在差异，耳聋基因突变阳性检出率不尽相同。本研究筛查4 个基因15 个位点，而阮宇等[16]筛查的是4 个基因9 个位点，由于筛查突变位点的增加，耳聋基因突变阳性检出率有所增高。本研究4 个基因中，GJB2 基因突变最高，纯合和复合杂合突变率为0.06%，杂合突变率为2.99%；其次为SLC26A4 杂合突变，突变率为1.59%。GJB2 基因中，c.235delC 突变最多，达131 例，突变率为2.48%；SLC26A4 基因中c.919-2A＞G 突变最多，为59 例，突变率为1.12%，与阮宇等[16]报道一致，表明了杭州地区耳聋基因突变携带率和常见突变类型与国内其他地区研究报道基本一致。

本研究280 例耳聋基因突变中，150 例新生儿父母进行了耳聋基因突变筛查验证，结果135 例新生儿突变来源于无表型的父母一方，占90.0%。还对22 例携带GJB2 和SLC26A4 基因突变的新生儿进行基因测序诊断，确定GJB2 基因c.235delC 纯合突变2 例，GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 复合杂合突变1 例，与筛查结果一致，同时发现4 例为GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变，父母经验证分别为相应位点突变的携带者。说明新生儿耳聋基因突变大部分是遗传父母，少部分才是基因突变所致。提示在孕前、孕期进行夫妻耳聋基因筛查可以有效检出胎儿的耳聋基因携带状况，如果夫妻双方均为同一基因携带者，根据耳聋的主要遗传方式——常染色体隐性遗传，即有1/4 可能出生聋儿，可进行婚育指导和产前诊断，以减少耳聋的出生。

从耳聋基因突变状态与听力筛查结果比较中发现，耳聋基因未突变，听力初筛与复筛未通过率为0.05%，低于耳聋基因突变新生儿的1.79%，差异有统计学意义，与王川等[17]报道一致。说明新生儿耳聋基因突变携带与听力筛查不通过两者有相关性，所以通过听力-耳聋基因联合筛查，以确定先天性耳聋的高危人群，并对高危人群尽早听力诊断加以确诊，有利于早期采取干预，避免由聋致哑。

按照新生儿听力筛查规范要求，常规听力筛查未通过，初次诊断性听力评估在3 个月左右完成，最后确诊耳聋还要延后，但结合耳聋基因筛查结果，可以在出生2 个月就进入到听力诊断的阶段，尽早发现和干预患儿。本研究还对听力筛查通过而基因测序诊断为GJB2基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变的新生儿进行随访，出生3 个月听力均诊断正常，由于GJB2 基因c.109G＞A 位点突变外显不全，对于GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位点复合杂合突变，是否表现听力障碍，目前各个研究者认识不一致，国内外尚无相关报道，即使出生后听力筛查与诊断正常，但仍需要长期随访听力发育，一旦发现听力异常需及时干预。本研究对14 例携带线粒体12SrRNA 基因突变的新生儿进行药物性耳聋高危用药指导，避免用药致聋；对18 例GJB3基因突变携带者和3 例双基因杂合突变者嘱其父母注意听力发育及生活指导。

综上所述，本研究通过听力-耳聋基因联合筛查与诊断，在出生3 个月确诊中重度耳聋4 例，对不同的耳聋基因突变者进行个性化干预，达到了早发现、早诊断、早干预的目的。本研究为杭州地区开展新生儿听力-耳聋基因联合筛查提供了理论依据及基础数据，对提高杭州地区出生人口健康素质具有积极的意义。