樟芝多糖通过ROS-NOX2-NLRP1信号减轻皮层神经细胞炎症损伤的作用研究

沈和平 官俏兵 郝亚南 俞晓翔 王云 翟丽萍 韩晨阳

神经细胞损伤是大脑结构和功能改变的主要原因，而神经细胞损伤最终可以造成认知障碍，甚至发展为阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病[1-2]。在这类疾病中，炎症因子的产生和释放是引起神经细胞损伤的主要原因。研究发现脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导后大脑皮质和海马组织中炎症因子的表达大量上调[3-4]，此外，LPS 还可以进一步激活小胶质细胞。活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以促进神经细胞炎症的产生，还可以进一步调节下游还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NADPH oxidase 2,NOX2）的表达[5-6]。NOX2 可以调控中枢病理性氧化应激反应，ROS 通过NOX2 进一步促进炎性小体NLRP1激活，而神经细胞的炎症反应主是NLRP1 介导的[7-8]。因此，ROS-NOX2-NLRP1 轴在神经细胞炎症反应中有着重要的作用，也是炎症反应的重要靶点。在ROS 的研究中常用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）作为抑制剂。樟芝是一种多孔菌科真菌，也是一种食用/医用两用的真菌，其含有多种活性物质。前期研究发现樟芝多糖（antrodia camphorata polysaccharide,ACP）对于帕金森病，尤其是神经细胞有着良好的保护作用，其机制和炎症的调控有关[9-10]。神经细胞损伤是导致帕金森病的重要因素，所以进一步揭示ACP 抑制神经细胞炎症损伤的机制对于深入了解ACP 的药理作用有着重要的意义。本研究主要探讨ACP 通过抑制ROSNOX2-NLRP1 信号减轻CNC 炎症损伤的作用和机制。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 小鼠皮层神经细胞（cortical neuron cell,CNC）（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CPM143）及其完全培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CM-M143）；细胞活力CCK-8 检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：CA1210）；Annexin VFITC/PI 流式双染细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：CA1220）；ROS 检测探针DCFH-DA（北京索莱宝科技有限公司，批号：D6470）；ELISA 检测试剂盒IL-1β、IL-6、TNF-α（南京建成生物工程研究所，批号：H002、H007、H052）；LPS（美国Sigma 公司分装）；NAC（中国MCE 公司，批号：HY-B0215）；ACP（实验室自备，纯度95%以上）。

1.2 细胞分组及药物干预 CNC 用完全培养基培养，待细胞生长至对数期，融合70%～80%左右，将细胞用胰蛋白酶消化后分组。在研究ACP 抗炎症反应作用的实验中，将CNC 细胞分为对照组、LPS 组、ACP 5 mg/L组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组。对照组为常规培养的细胞，无LPS 和ACP 干预；LPS 组用0.1 mg/L LPS 诱导细胞炎症反应；ACP 各组分别使用终浓度为5、10、20 mg/L 的ACP 进行预处理6 h 后，再用0.1 mg/L LPS 诱导细胞炎症反应。在研究ACP 通过抑制ROS 发挥作用的机制研究中，将CNC 分为LPS 组、NAC 组和NAC+ACP 组。LPS 组用0.1 mg/L LPS 诱导细胞炎症反应；NAC 组用10 mM NAC 预处理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS 诱导细胞炎症反应；NAC+ACP 组同时用10 mM NAC 和20 mg/L ACP 预处理4 h 后，再用0.1 mg/L LPS诱导细胞炎症反应。

1.3 细胞活力检测 采用CCK-8 法。将CNC 接种到96 孔板后，每组细胞设置3 个复孔（以下检测相同），待药物干预后，于0、3、6、12、24 h 进行细胞活力检测。将每孔培养基吸去后再加入100 μl 完全培养基，同时加入10 μl CCK-8 溶液，继续孵育4 h，待细胞染色后，在450 nm 处检测吸光度（OD）值，同时设置空白培养基为对照。细胞活力=（OD实验组-OD对照）/（OD初始-OD对照）×100%。

1.4 细胞凋亡水平检测 采用Annexin V-FITC/PI 双染后流式细胞术。将细胞接种到6 孔板中，干预12 h后，用0.25%胰蛋白酶消化，PBS 清洗后，2 000 r/min离心10 min，收集细胞后用预冷的PBS 重悬，再次2 000 r/min 离心10 min 后用Binding Buffer 进行悬浮，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，避光15 h 后，用5 μl PI 染色5 min，上机检测。

1.5 细胞ROS 水平检测 采用DCFH-DA 探针。将细胞接种到6 孔板中，药物干预12 h 后弃去培养基。按照1∶1 000 的比例用无血清培养基稀释DCFH-DA 探针，每孔加入1 ml 的含DCFH-DA 探针的培养基，在培养箱中继续孵育30 min。弃去培养基，用无血清培养基洗涤细胞2 次。荧光显微镜下观察细胞染色水平，同时检测荧光光度值。

1.6 细胞NOX2、NLRP1 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。药物干预12 h 后收集细胞，PBS 洗2次后加入1.0 ml 的RIPA 裂解液在冰上裂解30 min，10 000 g 转速下离心15 min，取上清液进行BCA 试剂盒的蛋白定量检测。根据分子量不同分别配置8%～12% SDS-PAGE 凝胶，取蛋白液后用5×loading buffer补充体积至20 μl，煮沸8 min 后，80 V 电压进行电泳，之后转换为120 V 电压继续电泳。将凝胶去除后进行PVDF 膜的转膜，采用300 mA 恒流转膜0.5～2 h，PVDF 膜使用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 稀释一抗，NOX2、NLRP1 的一抗稀释比例分别为1∶500、1∶500、1∶600，一抗孵育后PVDF 膜用TBST 洗2 次后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育，二抗稀释比例为1∶2 000。孵育完成后用化学发光法检测，采用Image Pro-Plus 6.0 软件进行光密度的分析，以GAPDH 为内参，结果以目的蛋白与内参蛋白光密度值比值表示。

1.7 细胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 表达水平检测 根据试剂盒说明书进行标准曲线的测定。CNC 分组培养，在ACP 干预12 h 后收集细胞培养基，培养基在2 000 r/min 离心15 min，除去细胞碎片和悬浮细胞，取上清液，参照ELISA 检测试剂盒说明书检测，利用测定的标准曲线计算细胞因子水平。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 校正的t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACP 对于LPS 诱导下CNC 细胞活力的影响 0 h时5 组细胞活力比较差异无统计学意义（P ＞0.05）；而LPS 干预后，与对照组同一时间点比较，LPS 组细胞活力均明显下调（均P＜0.05）；而ACP 干预后，与LPS 组同一时间点比较，ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组细胞活力均明显上调（均P＜0.05）；且随着ACP 浓度的升高，细胞活力明显上调（P＜0.05），见图1。

2.2 ACP 对于LPS 诱导下CNC 细胞凋亡的影响 对照组、LPS 组、ACP 5 mg/L 组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组细胞凋亡率分别为（6.43±0.65）%、（58.65±5.54）%、（38.76±4.55）%、（28.65±3.65）%和（18.65±3.11）%。LPS 干预后，与对照组比较，LPS 组细胞凋亡率明显上调（P＜0.05）；而ACP 干预后，与LPS 组比较，ACP 5 mg/L 组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组细胞凋亡率均下调（均P＜0.05）；且随着ACP 浓度的升高，细胞凋亡率明显下调（P＜0.05），见图2。

2.3 ACP 对于LPS 诱导下CNC 中ROS 产生及NOX2、NLRP1 蛋白表达的影响 对照组、LPS 组、ACP 5 mg/L组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组细胞中ROS 的荧光光度值分别为0.03±0.01、0.27±0.08、0.18±0.06、0.11±0.03、0.07±0.01。与LPS 组比较，ACP 5 mg/L 组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组细胞中ROS 的荧光光度值均降低（均P＜0.05）；且随着ACP 浓度的升高，细胞中ROS 的荧光光度值明显降低（P＜0.05），见图3（插页）。与对照组比较，LPS 组NOX2 和NLRP1 蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）；经ACP 干预后，与LPS 组比较，ACP 5 mg/L 组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L 组NOX2和NLRP1 蛋白表达水平均降低（均P＜0.05），见图4。

图1 樟芝多糖（ACP）对于脂多糖（LPS）诱导下皮层神经细胞（CNC）细胞活力的影响（与对照组同一时间点比较，*P＜0.05；与LPS 组同一时间点比较，△P＜0.05）

图2 樟芝多糖（ACP）对于脂多糖（LPS）诱导下皮层神经细胞（CNC）细胞凋亡的影响

图4 樟芝多糖（ACP）对于脂多糖（LPS）诱导下皮层神经细胞（CNC）中NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表达的影响（a：各组细胞NOX2 和NLRP1 蛋白表达的电泳图；b：各组细胞NOX2和NLRP1 蛋白表达水平比较，与对照组比较，*P＜0.05；与LPS 组比较，△P＜0.05）

图3 樟芝多糖（ACP）对于脂多糖（LPS）诱导下皮层神经细胞（CNC）中活性氧（ROS）的产生的影响

2.4 ACP 对于LPS 诱导下CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α水平的影响 与对照组比较，LPS 组IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均升高（均P＜0.05）；经ACP 干预后，与LPS组比较，ACP 5 mg/L 组、ACP 10 mg/L 组和ACP 20 mg/L组IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均降低（均P＜0.05）；且随着ACP 浓度的升高，IL-1β、IL-6 和TNF-α 表达水平均下降（均P＜0.05），见图5。

图5 樟芝多糖（ACP）对于脂多糖（LPS）诱导下皮层神经细胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响（与对照组比较，*P＜0.05；与LPS 组比较，△P＜0.05）

2.5 NAC 抑制ROS 后，ACP 对于CNC 细胞凋亡的影响 LPS 组、NAC 组和NAC+ACP 组细胞凋亡率分别为（56.98±6.54）%、（28.54±4.23）%和（24.63±3.65）%。与LPS 组比较，NAC 组和NAC+ACP 组细胞凋亡率均下调（均P＜0.05）；而NAC 组和NAC+ACP 组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图6。

2.6 NAC 抑制ROS 后，ACP 对于ROS 产生及NOX2、NLRP1 蛋白表达的影响 LPS 组、NAC 组和NAC+ACP组细胞中ROS 的荧光光度值分别为0.30±0.04、0.07±0.01、0.06±0.01。与LPS 组比较，NAC 组和NAC+ACP 组细胞中ROS 的荧光光度值均降低（均P＜0.05）；而NAC和NAC+ACP 组细胞中ROS 的荧光光度值比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图7（插页）。与LPS 组比较，NAC 组和NAC+ACP 组NOX2 和NLRP1 蛋白表达水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 组和NAC+ACP 组NOX2 和NLRP1 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见图8。

2.7 NAC 抑制ROS 后，ACP 对于CNC IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响 与LPS 组比较，NAC 和NAC+ACP组IL-1β、IL-6 和TNF-α 表达水平均降低（均P＜0.05）；而NAC 组 和NAC+ACP 组IL-1β、IL-6 和TNF-α 表达水平比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见图9。

图6 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）对于皮层神经细胞（CNC）细胞凋亡的影响（LPS 为脂多糖）

图7 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）对于ROS 产生的影响（LPS 为脂多糖）

图8 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）对于NADPH 氧化酶2（NOX2）、NLRP1 蛋白表达的影响[a：各组细胞NOX2 和NLRP1 蛋白表达的电泳图；b：各组细胞NOX2 和NLRP1 蛋白表达水平比较，与脂多糖（LPS）组比较，*P＜0.05]

图9 N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制活性氧（ROS）后，樟芝多糖（ACP）对于皮层神经细胞（CNC）IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响[与脂多糖（LPS）组比较，*P＜0.05]

3 讨论

神经细胞损伤是多种类型神经系统疾病的重要事件，在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症以及脑缺血疾病中，神经细胞损伤都可以造成中枢不可逆转的伤害，而在损伤的机制研究中，氧化应激、线粒体功能损伤、慢性炎症等都可以造成神经细胞的损伤[11-12]。ROS 目前被认为是氧化损伤的重要因素。ROS 是正常的代谢产物，其中包括超氧阴离子、羟基自由基以及氧自由基等。细胞的ROS 主要有外源性和内源性两种，内源性ROS 主要由线粒体呼吸链NOX 系统产生[13]。线粒体作为ROS 的主要来源，可以产生大多数ROS。线粒体电子传递链主要由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶、琥珀酸氧化还原酶、细胞色素C 还原酶等构成。NOX 是一种跨膜的酶复合物，其中NOX2 主要表达于吞噬细胞、神经细胞以及心机细胞[14-15]。在人的神经组织，包括海马区、脊髓、皮质区等都有NOX2 的表达。NOX2 在正常生理环境下保持动态平衡，而接受外界信号后可以迅速产生ROS，造成细胞内NOX2 浓度的升高，ROS增高主要可以介导炎症反应的发生[16-17]。ROS 主要可以通过酪氨酸磷酸化系统、转录因子家族、丝裂原活化蛋白激酶等刺激炎症的产生。目前ROS 被认为可以激活炎性小体的产生。NLRP1 是一种炎性小体，主要包括感受器NLRP1、凋亡相关斑点样蛋白以及效应蛋白Caspase-1，3 种蛋白相互作用形成高分子的蛋白复合体，激活Caspase 加速，迅速进行炎症因子IL-1β、IL-6的切合，并释放到细胞外。研究发现NLRP1 在神经细胞损伤中发挥着重要的作用[18]。

ACP 是一种复合的多糖类化合物，课题组前期的研究中已经发现ACP 对于帕金森病等有着良好的治疗效果，其作用和炎症因子的调控有关[9-10]。而本研究主要以CNC 为对象，深入研究了ACP 的作用，结果发现LPS 诱导的神经细胞炎症模型中，ROS-NOX2-NLRP1 轴是激活的，ROS 水平迅速上调，可以诱导下游NOX2 和NLRP1 激活，这是神经细胞炎症反应的主要信号轴。而ACP 干预后，可以抑制ROS 的产生，探针检测结果也显示，ROS 荧光光度值下调，而NOX2 和NLRP1 蛋白表达也下调。虽然ACP 的干预抑制了ROS-NOX2-NLRP1轴，可以使细胞活力上调，细胞凋亡水平和炎症因子表达水平下调。但还需要进一步研究ACP 的具体作用机制，所以笔者采用NAC 进行处理。NAC 是一种ROS 的特异性抑制剂，可以抑制ROS 的产生。在此基础上将NAC 和ACP 联用，结果显示NAC 可以抑制ROS 的产生，从而抑制NOX2 和NLRP1 的激活。但是NAC 和ACP联用后，对比单一NAC 未见统计学差异。因此，笔者推测ACP 主要抑制了ROS 的产生，从而抑制下游NOX2-NLRP1 轴，改善了神经细胞的炎症损伤。

综上所述，ACP 可以通过抑制ROS 的表达抑制NOX2-NLRP1 激活，从而减轻CNC 的炎症反应。