miR-196b-5p 在食管鳞癌癌组织中的表达及作用机制

尹周亮 张波 张健 徐建峰

食管癌是世界第六大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大常见原因[1]，其中超过90%为食管鳞状细胞癌[2-3]。目前食管癌患者的预后仍不理想，中位生存时间仅为1.5 年，5 年生存率不到10%[4]。寻找食管癌的生物标志物和开发新的基因治疗，对降低食管癌患者死亡率具有重要意义。miRNA 作为一种转录后调控因子，可通过特异性结合靶mRNA 减少mRNA 翻译或降低靶mRNA 表达[5-7]。目前，miRNA 已被证实在肿瘤中存在差异表达，且参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。研究发现，miR-196b-5p 参与某些肿瘤的发生、发展，或可作为肿瘤生物标志物[8-9]。Shao 等[9]发现miR-196b-5p 在胃癌组织中高表达，且调控胃癌细胞的增殖和侵袭。另一研究显示，在胃癌患者的血清中，miR-196b-5p 同样存在高表达，且对胃癌诊断及预测淋巴结转移均具有一定的价值[10]。然而，目前关于miR-196b-5p 与食管癌的关系鲜有报道。基于此，本研究探讨miR-196b-5p 在食管鳞癌癌组织中的表达情况，评估miR-196b-5p 作为食管鳞癌潜在生物标志物的可能性，并进一步分析其作用机制，以期为miR-196b-5p 作为食管鳞癌生物标志物和治疗靶点提供理论支持。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2015 至2019 年浙江省台州医院收治的病理学检查确诊为食管鳞癌的24 例患者的癌组织及相应癌旁（距离肿瘤≥2 cm）正常组织标本，组织标本均由中心实验室规范保存。24 例食管鳞癌组织标本中男19 例，女5 例；年龄＜60 岁17 例，≥60 岁7例；肿瘤位置：食管近段～中段15 例，远段9 例；T 分期：T1～2期12 例，T3～4期12 例；N 分期：N0期14 例，Nx期10 例。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 组织标本miR-196b-5p 表达水平检测 采用qRT-PCR 法。取适量的组织放入无酶EP 管后上机研磨，在研磨后的组织中加入1 ml Trizol（美国赛默飞公司），严格按照反转录试剂盒（美国赛默飞公司）说明书要求提取总RNA。将2×Master Mix、50×ROX Reference Dye、引物（上海生物工程公司）、模板完全溶解，依照PCR 试剂（上海吉玛公司）说明书配制反应体系，设置3 个复孔进行PCR 扩增，结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。所有miRNA 表达数据采用log5（x）进行标准化处理。miR-196b-5p 上游引物：3'-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-5'，下游引物：3'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-5'；内参U6 上游引物：3'-CTCGCTTCGGCAGCACA-5'，下游引物：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。

1.3 癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）和基因表达汇编（gene expression omnibus，GEO）数据验证 从TCGA 数据库（https://cancergenome.nih.gov/）中下载食管鳞癌高通量基因测序数据和临床数据集，共95 例食管鳞癌癌组织和13 例癌旁正常组织的miRNA 表达数据纳入本研究。所有miRNA 表达数据采用log2（x）进行标准化处理。从GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载GSE43732 数据集，共115 例食管鳞癌组织和45 例癌旁正常组织的miRNA表达数据纳入本研究。所有miRNA 表达数据采用2n进行标准化处理。以上所有数据均来自有效信息，不包括遗失的数据。

1.4 患者分组定义 基于24 例食管鳞癌患者的miRNA 数据，定义癌组织中miR-196b-5p 表达水平高于截断值的患者为高表达患者，反之定义为低表达患者，以进行后续生存分析。另基于TCGA 完整的RNA、miRNA 和临床数据，按食管鳞癌癌组织中miR-196b-5p 表达水平从低到高对食管鳞癌患者进行排序，定义前1/3 患者为miR-196b-5p 低表达患者，后1/3 患者为miR-196b-5p 高表达患者，以进行后续差异基因的富集分析。

1.5 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析 利用R 包“limma”对miR-196b-5p 高表达和低表达患者进行差异基因筛选，设置阈值log 倍数变化（fold change，FC）＞0.5 且错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.1。利用DAVID 在线生物信息分析软件（https://david.ncifcrf.gov/）对miR-196b-5p 相关差异基因进行KEGG通路分析，P＜0.05 被认为富集显著。

1.6 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t 检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验。采用GraphPad 软件绘制ROC 曲线；生存分析的最佳截断值来自X-tile 软件[11]分析结果；通过Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，预后比较采用log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织miR-196b-5p 表达水平比较 qRT-PCR 检测结果、TCGA数据库和GEO 数据库中食管鳞癌患者癌组织miR-196b-5p 表达水平均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

2.2 miR-196b-5p 诊断食管鳞癌的效能 根据本研究24 例食管鳞癌癌组织标本qRT-PCR 检测结果计算，miR-196b-5p 水平诊断食管鳞癌的灵敏度为0.79，特异度为0.92，最佳截断值为1.542，AUC 为0.891（95%CI：0.767～0.962）（P＜0.01）；根据TCGA 数据计算，灵敏度为0.86，特异度为0.85，最佳截断值为5.310，AUC 为0.832（95%CI：0.748～0.897）（P＜0.01）；根据GEO 数据计算，灵敏度为0.89，特异度为0.96，最佳截断值为0.012，AUC 为0.946（95%CI：0.900～0.975）（P＜0.01），见图1。

2.3 不同临床特征食管鳞癌患者癌组织中miR-196b-5p 表达水平比较 本研究24 例食管鳞癌患者中，T3～4期患者癌组织中miR-196b-5p 表达水平高于T1～2期患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；但不同性别、年龄、肿瘤位置和N 分期患者癌组织miR-196b-5p表达水平比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表2。

2.4 食管鳞癌癌组织miR-196b-5p 高表达与低表达患者生存情况比较 X-tile 软件显示进行生存分析时miR-196b-5p 表达水平的最佳截断值为1.898。本研究24 例食管鳞癌患者中，13 例miR-196b-5p 低表达（≤1.898）患者3 年生存率为55.3%，明显高于11 例miR-196b-5p 高表达（＞1.898）患者的0.0%，差异有统计学意义（χ2=4.412，P=0.036），见图2。

2.5 KEGG 富集分析miR-196b-5p 在食管鳞癌中的信号通路 通过R 包“limma”共筛选出173 个差异基因，对这些差异基因进行KEGG 富集分析显示，差异基因显著富集于有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Wnt、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等多条通路（均P＜0.05）。前10 项通路富集见表3。

3 讨论

食管癌患者无论是局部转移还是远处转移，其预后通常较差。因此，早期筛选食管癌患者并进行有效的治疗对于预后具有重要意义。本研究中，笔者探讨了miR-196b-5p 在食管鳞癌癌组织中的表达情况，并进一步分析其可能参与的信号通路。

本研究结果显示，miR-196b-5p 与食管鳞癌的发生关系密切。与癌旁正常组织相比，食管鳞癌患者癌组织中miR-196b-5p 表达水平明显上调，ROC 曲线分析结果显示miR-196b-5p 预测食管鳞癌的AUC 值为0.891，具备较高的灵敏度和特异度。这一结论得到TCGA 和GEO 数据分析结果的支持。同时，本研究结果还显示T3～4期食管鳞癌患者癌组织中miR-196b-5p 表达水平高于T1～2期患者，提示miR-196b-5p 与食管鳞癌进展有关。生存分析结果显示食管鳞癌癌组织中miR-196b-5p 高表达患者的预后较低表达患者差。另外，本研究显示miR-196b-5p 可能通过参与MAPK、Wnt、PI3K/Akt 等多条信号通路的调控，从而影响食管鳞癌的发生和发展。

表1 食管鳞癌患者癌组织与癌旁正常组织miR-196b-5p 表达水平比较

图1 miR-196b-5p 诊断食管鳞癌的ROC 曲线（TCGA 为癌症基因组图谱；GEO 为基因表达汇编）

表2 不同临床特征食管鳞癌患者癌组织miR-196b-5p 表达水平比较

图2 食管鳞癌组织miR-196b-5p 高表达与低表达患者生存曲线比较

表3 前10 项KEGG 通路富集结果

研究显示miR-196b-5p 在胃癌[9]、结直肠癌[8]、非小细胞癌[12]和乳腺癌[13]等多种肿瘤中表达失调。已有研究表明，miR-196b-5p 在胃癌患者癌组织和外周血清中均显著上调，可作为胃癌诊断的潜在生物标志物和淋巴结转移的预测因子，具有重要的临床价值[9-10]。与此同时，Ren 等[8]和Xu 等[14]发现miR-196b-5p 在结直肠癌患者癌组织和外周血清中均存在高表达，在结直肠癌诊断中具有一定的临床价值，且高表达的miR-196b-5p 与淋巴结浸润、分化程度及淋巴结转移有关。上述研究显示，miR-196b-5p 可作为某些特定肿瘤诊断的潜在生物标志物。

研究发现miR-196b-5p 可通过调节靶基因从而调控胃癌[9]、结直肠癌[15]、口腔癌[16]等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭。尽管如此，miR-196b-5p 对信号通路的调控作用却鲜有研究。Li 等[17]研究表明，miR-196b-5p 可通过PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控胃癌细胞的增殖和侵袭。PI3K/Akt 信号通路在过去被发现参与包括食管鳞癌在内的多种肿瘤细胞的凋亡、增殖和转移[18-19]。笔者过去的一项研究表明，miR-30b-5p 可通过PI3K/Akt 信号通路调控食管鳞癌细胞的迁移和侵袭[20]。另外，MAPK 和Wnt 等信号通路也被证实与食管鳞癌关系密切[21-22]。

综上所述，miR-196b-5p 在食管鳞癌的发生中起着重要作用。食管鳞癌癌组织中miR-196b-5p 表达水平明显高于癌旁正常组织，或可作为食管鳞癌筛选的潜在生物标志物。miR-196b-5p 可能通过参与调控多条信号通路，在食管鳞癌发生中起致癌作用。本研究也存在一些不足，如缺少食管鳞癌患者外周血的检测以进一步明确miR-196b-5p 作为筛选因子的潜能；信号通路方面仍需细胞、动物实验进一步验证。