黄晓军 陈茜圆 任卓超 金兴
感染性休克患者平均死亡率高达42.9%,是重症患者的首要致死原因[1-2]。感染性休克过程中,诱发大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)和炎性介质释放,导致全身炎症反应综合征的发生,出现多器官功能不全甚至多系统器官功能衰竭[3]。感染性休克会导致严重的肺损伤,发生急性呼吸衰竭。大量研究显示,氧化应激在感染性休克发生、发展过程中起到重要作用[4-6]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)前体,具有很强的抗氧化、抗自由基作用[7-8]。本研究拟评价NAC 能否通过抗氧化应激、抗炎作用,起到减轻感染性休克小鼠肺损伤的作用。
1.1 实验动物 6~8 周雄性SPF 级C57BL/6 小鼠30只,由江苏集萃药康生物公司提供。在屏障环境下饲养,室温20~25 ℃,12 h 光照/12 h 黑暗交替,均自由摄食摄水。操作均严格遵守《实验动物管理条例》的相关规定。
1.2 实验试剂 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(L2880)、NAC(A7250)均购自美国Sigma 公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(A003-1-2)购自南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(KGT001100-2)、TNF-α 试剂盒(KGEMC102a-1)及IL-6 试剂盒(KGEMC004-1)均购自南京凯基生物科技公司。
1.3 动物分组及模型制作 采用随机数字表法将小鼠分为对照组、模型组和NAC 干预组3 组,每组10 只。模型组和NAC 干预组腹腔注射LPS(25 mg/kg,溶于0.2 ml 0.9%氯化钠注射液)制备内毒素诱发感染性休克模型[9],对照组则腹腔内注射等量0.9%氯化钠注射液。NAC 干预组注射LPS 后即刻腹腔注射NAC(300 mg/kg,溶于0.2 ml 0.9%氯化钠注射液)[10],而对照组和模型组腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液。6 h 后处死小鼠,并立即取出肺组织。
1.4 肺组织形态学变化观察 取部分右肺组织,10%甲醛固定后,经梯度乙醇脱水,二甲苯处理后,常规石蜡包埋,切片,HE 染色,光镜下观察肺组织形态学变化。根据肺泡腔及间隔炎症细胞渗出情况(0~3 分)、肺泡间隔增宽情况(0~3 分)、肺泡腔出血情况(0~3 分)、肺泡纤维蛋白渗出情况(0~3 分)进行评分,4 项总分为肺组织病理损伤评分[11-12]。
1.5 肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量、SOD 活性测定 取左肺组织制备10%组织匀浆,按照试剂盒说明书,采用ELISA 法测定肺组织中炎症介质IL-6、TNF-α 水平,采用比色法测定肺组织中氧化应激产物MDA 含量和抗氧化酶SOD 活性。
1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以表示,方差齐时,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t 检验;方差不齐时,多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验,两两比较采用Mann-Whitney U 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 肺组织形态学变化 光镜下,对照组肺组织结构清晰,肺泡间隔无增宽,可见少量炎性细胞浸润;模型组肺组织损伤明显,肺泡间隔增宽,肺间质及肺泡腔可见大量炎性细胞;NAC 干预组相对模型组肺损伤程度减轻,见图1。对照组、模型组和NAC 干预组肺组织病理损伤评分分别为(1.07±0.30)、(7.31±1.10)和(5.57±0.88)分,3 组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,模型组和NAC 干预组肺组织病理损伤评分均升高(均P<0.05);与模型组比较,NAC 干预组肺组织病理损伤评分降低(P<0.05)。
2.2 3 组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比较 与对照组比较,模型组和NAC 干预组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均升高,SOD 活性降低(均P<0.05);与模型组比较,NAC 干预组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低,SOD 活性升高(均P<0.05),见表1。
本研究以腹腔注射LPS 制备内毒素诱发感染性休克模型,该模型已很成熟,笔者也在前期的研究中反复证实了该模型的可靠性。本研究通过NAC 干预感染性休克小鼠模型,结果表明,NAC 可减轻LPS 诱导的感染性休克小鼠肺损伤的严重程度,可使肺组织中SOD 活性升高,IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低。SOD 是一种抗氧化酶,它可以清除氧化应激过程中产生的过多ROS,对机体起到非常重要的保护作用。MDA 是氧化应激过程中产生的高细胞毒性物质,MDA 对机体的危害极大,它与蛋白质、酶发生交联反应而影响其功能。说明NAC 可以通过其抗氧化和抗炎作用,起到保护感染性休克小鼠肺损伤的作用。
图1 3 组小鼠肺组织病理切片所见[a:对照组;b:模型组;c:N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预组;HE 染色,×200]
表1 3 组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比较
NAC 作为祛痰剂应用于临床多年。近年研究表明,NAC 具有很强的抗氧化、去除自由基作用。NAC 的抗氧化应激作用在国内外许多研究中均得到了证实。Hegab 等[13]在“NAC 和金雀异黄素对吲哚美辛诱导的胃损伤模型的保护作用”的研究中发现,NAC 预处理可明显改善溃疡指数,增加NO 水平和SOD 活性,同时明显降低MDA、TNF-α 水平和髓过氧化物酶(MPO)活性。Maheswari 等[14]在“评估NAC 对卡马西平引起的肝毒性的肝保护作用”研究中观察到,NAC 可使GSH 升高,脂质过氧化反应水平降低,并逆转卡马西平诱导的组织病理学异常。Hu 等[15]研究表明,NAC 可降低非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠骨髓中的ROS 水平。
感染性休克是重症患者死亡的首要原因,虽然现今的医疗手段已有很大的提高,但其死亡率仍居高不下。研究表明,感染性休克中机体产生的过多ROS 在全身炎症反应综合征、多器官功能不全的发生和发展过程中起重要作用,因此认为感染性休克是一种高氧化应激疾病[3]。肺是机体通气和氧气交换器官,肺组织氧含量高,因此肺脏也是最容易受到ROS 损害的脏器。感染性休克会导致严重的肺损伤,发生急性呼吸衰竭。转录因子NF-E2 相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2)在机体抗氧化应激中起到重要的保护作用。正常生理情况下,Nrf2 同胞质蛋白伴侣分子Keap1 偶联,Nrf2 的生物活性受到抑制;当机体产生大量ROS,处于氧化应激状态时,Nrf2 会从Keap1 解离出来并进入细胞核,激发细胞内抗氧化反应元件调控的相关抗氧化和抗炎基因的表达,从而起到对机体的保护[16-17]。NAC 对感染性休克小鼠的肺损伤保护作用可能与其激活Nrf2 有关[18-19],NAC 通过上调Nrf2,激活相关抗氧化基因的表达,使肺组织中抗氧化指标升高,氧化应激损伤指标和炎症介质水平降低,从而起到减轻感染性休克小鼠肺损伤的作用。
综上所述,NAC 可通过抗氧化应激及清除氧自由基相关物质,从而对内毒素诱发感染性休克小鼠肺损伤起到保护性作用。但感染性休克是一种全身性疾病,可以导致肺、肝、肾、心脏等多脏器功能异常。NAC 能否对其他脏器产生保护作用、改善感染性休克总体预后有待进一步研究;如何优化NAC 的用药方式有待进一步研究和探讨。