抑郁对哮喘模型小鼠气道炎症及气道高反应性的影响

周燕 金华良 王利民 叶健 厉蓓 蔡萃

哮喘患者伴有抑郁相当普遍，在华东地区尤为常见，已造成巨大的社会负担和经济损失，因此成为备受关注的公共卫生问题。研究提示抑郁是发生哮喘的风险标志物，且抑郁患者哮喘的发病率明显增加[1]；同样，哮喘患者发生抑郁的风险较普通人群明显升高[2]。长期抑郁可使哮喘控制测试（asthma control test,ACT）评分明显降低，气道炎症加重，使哮喘治疗的依从性受到严重影响[2]，导致哮喘急性发作的频率明显增加，生活质量明显下降[3-4]。然而抑郁引起哮喘症状加重的机制较为复杂，目前尚未阐明。气道炎症是哮喘关键的发病机制，而气道高反应性则是哮喘的重要特征，因此本研究通过制备哮喘伴抑郁动物模型，探讨抑郁对哮喘动物气道炎症及气道高反应性的作用。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 卵蛋白（规格：V 级-50 g，批号：1001911682）、乙酰甲胆碱（规格：1 g，批号：PHR1943-1G）购于美国Sigma 公司；地塞米松（1 ml∶5 mg，批号：200210）购于广州白云山天心制药股份有限公司；免疫佐剂（imject alum，规格：50 ml，批号：77161）购于美国Thermo Fisher 公司；小鼠ELISA 试剂盒：IL-4（规格：96 T，批号：A204H90554），IL-5（规格：96 T，批号：A205H90135）及IL-13（规格：96 T，批号：A21390732）均购于美国ebioscience（San Diego）公司；IgE 小鼠ELISA试剂盒（规格：96 T，批号：0574155）购于美国Cayman 公司；小鼠无约束全身体积描记系统（型号：NAM）购于美国Buxco 公司；雾化器（型号：PARI Boy Sx 085G3005）购于德国百瑞公司；小动物行为学视频记录与分析系统（型号：SMART V3.0）购于西班牙Panlab 公司。

1.2 实验动物及分组 健康6 周龄雄性Balb/c 小鼠40只，体重16～20 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。采用随机数字表法分为正常组、单纯哮喘组、哮喘伴抑郁组和地塞米松组4 组，每组10 只。正常组采用0.9%氯化钠溶液雾化吸入；单纯哮喘组采用卵蛋白致敏与激发制备单纯哮喘模型；哮喘伴抑郁组和地塞米松组则在哮喘模型基础上给予4 周未预知的慢性应激刺激；地塞米松组从给予慢性应急刺激开始起采用地塞米松0.5 mg/kg，1 次/d，干预4 周，其余各组采用0.9%氯化钠溶液。

1.3 模型制备

1.3.1 单纯哮喘模型 实验第0 天在小鼠腹膜腔内注射致敏液（含卵蛋白40 μg、佐剂凝胶imject alum 0.05 ml、0.9%氯化钠溶液约0.15 ml）0.1 ml，同时给予致敏液皮下注射0.1 ml，第7 天重复致敏，第14 天起予每日上午以1%卵蛋白雾化吸入激发哮喘5 周。

1.3.2 哮喘伴抑郁模型 第21 天起在单纯哮喘模型基础上制作抑郁模型，给予未预知的慢性应激刺激，包括6 ℃冰水游泳5 min，44 ℃热烘5 min，夹尾1 min，潮湿垫料饲养（每100 g 玉米芯加200 ml 水）8 h、禁食水15 h，通宵照明12 h，束缚在狭小的管子1 h，鼠笼倾斜30° 3 h 等刺激，刺激随机安排4 周。第21 天起每日上午以1%卵蛋白雾化吸入激发哮喘0.5 h，连续4 周以维持哮喘症状。

1.4 旷场试验分析小鼠行为学变化 为鉴定抑郁模型是否成功建立，采用SMART V3.0 行为学视频记录与分析系统对小鼠抑郁状态，自发活动，探索行为进行定量评价。试验开始前小鼠先适应环境2 h，将小鼠放入旷场装置中央，并打开摄像系统，采用SMART V3.0 行为学视频记录与分析系统分析小鼠中央活动时间（即潜伏期）、中央活动距离/总的活动距离比等参数。

1.5 强迫游泳试验分析小鼠抑郁水平 对各组小鼠进行强迫游泳试验，将小鼠置于水深l5 cm，直径约10 cm，水温25 °C 的玻璃容器内，让其强迫游泳6 min，采用SMART V3.0 行为学视频记录与分析系统分析第3～6 min 内小鼠漂浮不动的时间（强迫游泳试验不动时间）（即小鼠一开始在水中拼命游泳、攀爬容器内壁试图逃跑，到一定时间后放弃挣扎，仅有微小的肢体运动以维持头部露出水面呼吸，呈漂浮状态）。

1.6 气道高反应检测 采用无创肺功能仪。造模结束后，将自然状态下的小鼠置入体描箱中，先测定基础增强呼气间歇（enhanced pause，Penh）值，以反映气道高反应程度。随后用乙酰甲胆碱激发，浓度由低到高依次为0、6.25、12.5、25 和50 g/L，每次雾化吸入2 min，记录3 min，记录不同浓度乙酰甲胆碱激发的Penh 值。Penh计算公式：呼气峰压力（PEP）/吸气峰压力（PIP）×呼气间歇（Pause），其中Pause=[呼气相时间（Te）-呼气相松弛时间（Tr）]/Tr。

1.7 血清IgE 水平测定 测定肺功能后，给予小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，予以心脏采血，3 000 r/min离心10 min 后，分离血清，采用ELISA 法测定血清IgE水平。

1.8 肺泡灌洗液细胞因子检测 使用注射器吸取1 ml PBS 从导管缓慢注入灌洗双肺，可见小鼠肺部逐渐膨胀，颜色由红色变成粉白色，待液体完全进入肺内，轻压肺部，以保证充分灌洗，5 s 后回抽液体，反复2 次，回收率为60%～80%。将液体3 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用ELISA 法测定肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平。

1.9 肺组织HE 染色 取右肺上叶，10%中性甲醛固定，脱水、石蜡包埋、连续切片，厚4 μm，行HE 染色，光镜下观察小鼠支气管黏膜下和周围肺组织炎性细胞浸润。参照文献[5]，对气道炎症程度进行评分：0 分：没有炎症细胞；1 分：少量炎症细胞；2 分：炎症细胞形成环状，层厚1 个细胞；3 分：炎症细胞形成环状，层厚2～4个细胞；4 分：炎症细胞形成环状，层厚4～5 个细胞；5分：炎症细胞形成环状，层厚＞5 个细胞。

1.10 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，方差齐性时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t 检验；方差不齐时，多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两两比较采用Mann-Whiteney U 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学变化比较 与正常组及单纯哮喘组比较，哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠中央活动时间和中央运动距离/总的活动距离比均明显减少（均P＜0.01）；而哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠中央活动时间和中央运动距离/总的活动距离比比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠行为学变化比较

2.2 各组小鼠强迫游泳试验不动时间比较 正常组、单纯哮喘组、哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠强迫游泳试验不动时间分别为（38.2±7.7）、（82.7±25.1）、（156.9±17.4）和（103.4±20.1）s，各组小鼠强迫游泳试验不动时间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组及单纯哮喘组比较，哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠强迫游泳试验不动时间均延长（均P＜0.05）；而哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠强迫游泳试验不动时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠不同浓度乙酰甲胆碱激发时Penh 值比较 不同浓度（6.25、12.5、25 g/L）乙酰甲胆碱激发下，与正常组、单纯哮喘组和地塞米松组比较，哮喘伴抑郁组小鼠Penh 值均明显升高（均P＜0.01），见图1。

图1 各组小鼠不同浓度乙酰甲胆碱激发时增强呼气间歇（Penh）值比较（与哮喘伴抑郁组比较，**P＜0.01）

2.4 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子及血清IgE 水平比较 与正常组比较，哮喘伴抑郁组小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平及血清IgE 水平均升高（均P＜0.01）。与单纯哮喘组比较，哮喘伴抑郁组小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平升高（P＜0.05），但两组小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-13 水平及血清IgE 水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与哮喘伴抑郁组比较，地塞米松组小鼠肺泡灌洗液IL-4、IL-5、IL-13 水平及血清IgE 水平均下降（均P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠肺泡灌洗液细胞因子及血清IgE 水平比较

2.5 各组小鼠肺组织气道炎症评分比较 正常组小鼠肺组织切片支气管管腔光滑，气道及肺泡见少量炎性细胞浸润；单纯哮喘组小鼠气道壁明显增厚，可见炎性细胞浸润在血管周围及支气管周围；哮喘伴抑郁组小鼠气道周围炎性细胞浸润最为显著，管腔狭窄，部分可见黏液栓子；地塞米松组小鼠气道壁炎性细胞浸润程度明显减轻，见图2。正常组、单纯哮喘组、哮喘伴抑郁组和地塞米松组小鼠肺组织气道炎症评分分别为（0.93±0.16）、（2.47±0.09）、（3.39±0.11）和（1.13±0.13）分。与正常组及单纯哮喘组比较，哮喘伴抑郁组小鼠肺组织小鼠气道炎症评分升高（均P＜0.05）；与哮喘伴抑郁组比较，地塞米松组气道炎症评分明显降低（P＜0.01）。

图2 各组小鼠肺组织病理HE 染色所见（a：正常组；b：单纯哮喘组；c：哮喘伴抑郁组；d：地塞米松组；HE 染色，×100）

3 讨论

哮喘患者较普通人群更易患抑郁，且两者存在相互作用[6]。最近一项研究显示中国约有4 500 万哮喘患者，然而其存在的抑郁等精神疾病通常被临床医师所忽视[7]。抑郁可显著加重哮喘患者的临床症状，但相关机制目前尚未阐释清楚。慢性气道炎症是哮喘的关键机制，而气道高反应性是哮喘的一个重要特征。因此，本研究通过构建哮喘伴抑郁模型，探讨抑郁对哮喘气道炎症及气道高反应性的作用。本研究发现，哮喘伴抑郁小鼠在旷场试验中央活动时间及中央活动距离/总的活动距离比均减少，同时强迫游泳试验不动时间延长，表明本研究抑郁模型制备成功。与单纯哮喘组比较，哮喘伴抑郁组小鼠气道反应性明显升高，肺泡灌洗液炎症因子及肺组织病理气道炎症明显升高，提示抑郁可显著加重哮喘气道炎症与气道高反应性。

研究认为抑郁是导致哮喘急性发作的重要诱因，同时抑郁与哮喘症状控制不佳，治疗依从性下降，生活质量降低显著相关[1]。此外，抑郁可上调全身炎症因子水平，从而导致哮喘症状显著加重[8]。既往研究发现抑郁可导致糖皮质激素不敏感，这提示哮喘伴抑郁患者可能较单纯哮喘存在更为明显的气道炎症[9]。本研究发现哮喘伴抑郁组小鼠肺组织气道炎症评分以及肺泡灌洗液IL-5 水平较单纯哮喘组明显升高，证实抑郁可显著加重哮喘气道炎症。地塞米松对抑郁的作用仍存在争议，既往研究提示地塞米松可改善抗抑郁药物敏感性，具备一定的抗抑郁作用[10]。但近年来研究发现长期给予地塞米松，可激活应激相关基因，从而导致小鼠抑郁样或焦虑样症状[11]。但本研究并未发现地塞米松上调慢性应激所致的抑郁水平。这可能与不同的实验造模方法、地塞米松的剂量以及所采用的的动物种类有关。

气道高反应是哮喘的一个显著特征，它是指气道对多种刺激物的反应性异常增高，表现为吸入各种刺激性物质后，异常敏感的气道较正常人更易出现支气管平滑肌的收缩，黏液分泌及免疫炎性介质释放，从而表现为气道阻力急速短暂或较长时间的上升，以及肺通气功能下降的一种特质[12]。哮喘气道炎症与气道高反应性密切相关，研究发现哮喘患者吸入IL-5 后，痰嗜酸性粒细胞显著升高，气道高反应显著增加[13]。本研究发现哮喘伴抑郁组小鼠较单纯哮喘组气道高反应性明显升高，而哮喘伴抑郁组小鼠肺泡灌洗液IL-5 及气道炎症均较单纯哮喘组明显升高，这提示气道高反应增加与气道炎症水平上调呈正相关。

综上所述，本实验通过比较哮喘伴抑郁模型与单纯哮喘模型，证实抑郁可显著加重哮喘气道炎症与气道高反应。因此，哮喘患者出现症状控制不佳可能与抑郁相关，临床医师应注意对哮喘患者进行抑郁等合并症评估。