非小细胞肺癌L861Q突变临床特征及与L858R对比研究

房延凤 马李杰 南岩东 张涛 任腾 苏蔚 刘雁声 惠盼 谯钰琪金发光 刘伟

1空军军医大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，西安710038；2西部战区总医院呼吸与危重症医学科，成都610083

非小细胞肺癌占肺癌的85%[1]，5年生存率约13%[2]。以EGFR酪氨酸酶抑制剂为代表的分子靶向治疗较化疗显著延长了患者无进展生存期。研究表明，EGFR-TKI治疗敏感性最高的经典突变为19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变[3-4]，其中L858R点突变占EGFR突变的40%～45%[5]。罕见突变占EGFR突变阳性NSCLC患者的7%～23%[6-8]，而21外显子上的少见突变L861Q约占2%[9]，且突变临床特征和对EGFR-TKI治疗的敏感性研究数据不多，有研究发现L861Q对EGFR-TKI治疗敏感性仅次于经典突变[10-12]，但部分研究显示L861Q呈低水平的敏感性[13]，甚至对EGFR-TKI治疗的完全抵抗[14]，疗效不佳[15]。本研究回顾性分析498例非小细胞肺癌患者通过ARMS法检测其EGFR基因上21外显子的L861Q、L858R2个突变位点，分析其突变临床特征及两者突变率的对比研究，有助于进一步总结归纳本地区非小细胞肺癌21外显子突变临床特征，构建基因突变临床特征模型。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年7月至2018年12月空军军医大学空军军医大学第二附属医院呼吸与危重症医学科确诊的非小细胞肺癌705例，包括腺癌464例，其他类型241例。其中男448例，女257例；年龄(65.96±12.36)岁。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 设备与方法

1.2.1 主要仪器和试剂 荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司，LightCycler480II)，台式高速离心机(美国Thermo公司，PICO17)，核酸蛋白定量仪(美国Invitrogen公司，Qubit2.0)，三孔电热恒温水槽(上海齐欣科学仪器有限公司，DK-8D)等。组织&血液DNA提取纯化试剂盒(德国QIAGEN公司，CatNo./ID：69504)，石蜡组织DNA提取纯化试剂盒(德国QIAGEN公司，Cat No./ID：56404)外周血游离核酸提取纯化试剂盒(德 国QIAGEN公 司，CatNo./ID：55114)，EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(苏州为真生物医药科技有限公司)。

1.2.2 核酸纯化 (1)胸水和新鲜组织：处理好样本之后，按照DNesasy®Blood&Tissue Kit(QIAGEN)流程纯化核酸。(2)外周血：采集患者化疗前或化疗后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp®Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程纯化ctDNA。(3)石蜡组织：取石蜡组织切片3～5μm厚，5～10片，按照QIAamp®DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程纯化核酸。

1.2.3 EGFR基因突变检测 于实时荧光定量PCR平台，用突变特异扩增PRCR和溶解曲线分析技术检测基因特定突变。

1.2.4 结果判读 阳性样本指有典型S型扩增曲线，且某个位点的ΔCt值在切值范围内，同时该位点的溶解峰形的Tm值与STD该位点溶解峰形的Tm值的差值绝对值小于或等于1。

1.3 统计学分析 用SPSS 26.0软件包处理数据，计量资料以x-±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数(%)表示，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入选患者Exon21外显子上L858R、L861Q突变情况 705例非小细胞肺癌中Exon21外显子上L858R、L861Q共突变80例，突变率11.348%，男性共突变31例，男性突变率6.920%，女性共突变49例，女性突变率19.066%。

2.2 L861Q、L858R突变临床特征对比

2.2.1 L861Q突变临床特征 705例非小细胞肺癌中L861Q突变13例，突变率1.844%；其中腺癌突变率高于其他病理类型，差异有统计学意义(P=0.004)。L861Q突变特征还表现在：年龄≥50岁组突变率高于年龄＜50岁组、女性组突变率高于男性组，不吸烟组突变率高于吸烟组，右肺肿瘤组突变率高于左肺肿瘤组，合并其他肿瘤组中仅13例腺癌未合并其他肿瘤患者突变，Ⅰ～Ⅲ期组突变率高于Ⅳ期组，并发骨、头颅转移组突变率高于相应的无转移组，无胸膜及淋巴结转移组突变率高于相应转移组，合并糖尿病、高血压组突变率高于未合并糖尿病、高血压组，但以上各项差异均无统计学意义(P值均＞0.05)，见表1。

2.2.2 L858R突变临床特征 705例非小细胞肺癌中L858R突变67例，突变率95.035%。女性组突变率高于男性组(χ2=19.562，P＜0.001)，不吸烟组突变率高于吸烟组(χ2=15.859，P＜0.001)，右肺肿瘤突变率高于左肺肿瘤(χ2=5.601，P=0.020)，腺癌组突变率高于非腺癌组(χ2=16.282，P＜0.001)，Ⅳ期组肿瘤突变率高于Ⅰ～Ⅲ期组(χ2=5.996，P=0.016)，见表1。

2.2.3 L861Q与L858R突变特征对比 L861Q与L858R突变在性别、年龄、是否吸烟、病理分型、肿瘤发生部位、是否合并其它肿瘤、有无并发骨转移突变临床特征相一致；肿瘤分期，是否并发胸膜、淋巴结、头颅转移及有无合并糖尿病、高血压突变临床特征相反，以上差异均无统计学意义(P值均＞0.05)，见表1。

3 讨论

本文705例非小细胞肺癌L861Q突变率略低于既往报道[9]，考虑与检测方法有关。腺癌组L861Q、L858R突变率高于其它类型，差异有统计学意义，既往研究认为EGFR突变在鳞癌中偶然检测到是对腺鳞癌或低分化癌的病例误诊[16]，本文中13例L861Q突变均发生于腺癌未合并其它肿瘤组，即21外显子的突变更易发生于腺癌。既往报道EGFR少见突变与吸烟之间存在显著关联[17-18]。本文L858R不吸烟组突变率高于吸烟组，差异有统计学意义；L861Q不吸烟组突变率高于吸烟组，但差异无统计学意义，考虑一方面与L861Q突变率低有关，另一方面L861Q少见突变与吸烟是否相关需进一步扩大样本量深入研究。腺癌患者L861Q突变率高于相应对照组，L858R突变率在非吸烟、女性、Ⅳ期、右肺、腺癌高于相应对照组，以上差异均有统计学意义(P值均＜0.05)，表明L861Q、L858R突变及EGFR-TKI治疗更倾向这种特征的患者。

国外有研究表明，肿瘤分期也会影响突变率。癌症基因组图谱队列中报道EGFR突变率11%，其对象主要为非转移性、手术切除的非小细胞肺癌，且未接受全身性的治疗[19]。本研究中不同临床分期的L861突变率Ⅰ～Ⅲ期组高于Ⅳ期组，差异无统计学意义(χ2=0.057，P＞0.05)；L858R突变率Ⅳ期组高于Ⅰ～Ⅲ期组，差异有统计学意义(χ2=5.996，P＜0.05)，即EGFR常见突变L858R腺癌Ⅳ期更易出现。一方面考虑入选病例大部分是临床分期，部分和术后分期存在一定差异，另一方面Ⅳ期腺癌患者无手术适应症，基因检测为首选，相比Ⅰ～Ⅲ期腺癌，Ⅳ期检测比例更高，故而检出常见突变L858R在Ⅳ期比例更高，后续需进一步深入研究。

表1 L861Q、L858R突变临床特征对比

本研究还发现发生于≥50岁不吸烟女性、右肺腺癌、未合并其他肿瘤、并发骨转移者的L861Q突变率高于相应对照组，L858R突变率临床特征与此相一致。而L861Q、L858R在肿瘤分期有无合并糖尿病、高血压和是否并发头颅、胸膜、淋巴结转移突变率临床特征相反，但差异均无统计学意义(P值均＞0.05)，L861Q、L858R突变临床特征的一致性和相反性内在机制还需进一步深入研究。据报道携带L858R突变的非小细胞肺癌EGFR-TKI疗效优于L861Q等少见突变的患者[20-28]，因此，L858R、L861Q突变的临床特征和疗效之间存在一定相关性。突变过程中有无其他通路同时激活的影响，如MDM2蛋白的产生[29]，需要大样本进一步深入研究。鉴定非小细胞肺癌患者临床特征为其接受EGFR-TKI治疗疗效预测提供了导向。

本研究未涉及复合突变及L861Q、L858R突变疗效对比研究，罕见的突变可能单独发生或与常见或罕见EGFR复合突变[30]，伴随基因检测技术的改进，少见突变的检出率可能比以前更高[31]。通过705例非小细胞肺癌患者L861Q、L858R突变临床特征研究，有助于进一步探索本地区21外显子的突变临床特征，优化非小细胞肺癌个体化治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突