肺癌表皮生长因子受体基因突变分型特征及临床意义研究

朱丽蒙，韩雪莹，马 楠，任晓妮，王小乐，张 暋

(郑州金域临床检验中心/郑州市分子医学诊断工程技术研究中心，河南 郑州 450016)

根据2020年肿瘤年报，肺癌是河南省发病率和死亡率排第一的恶性肿瘤，中晚期肺癌的5年生存率仅为15%，给肺癌患者造成严重的生命威胁和巨大的经济损失[1]。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)可特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)基因敏感突变位点，抑制肿瘤生长，改善晚期肺癌患者的生存和预后。美国国立综合癌症网(NCCN)2021年V1版《非小细胞肺癌诊治指南》中提出，所有局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者均应检测EGFR，EGFR基因敏感突变位点阳性患者才有可能从EGFR-TKI的靶向治疗中获益[2]。

EGFR基因突变主要分布在酪氨酸激酶区域的18～21号外显子上，已有报道的常见突变和罕见突变包括30余种，不同突变分型的靶向治疗效果和突变率不同[3]。例如，EGFR基因19号外显子缺失(19DEL)，约占肺癌EGFR突变的45%，预示患者对EGFR-TKI用药敏感；21号外显子L858R 突变也是主要的敏感突变类型，约占EGFR突变的40%；20号外显子T790M突变，是第790位密码子的苏氨酸(T) 被蛋氨酸(M) 替代，导致 EGFR TK区域与靶向TKI药物的亲和力降低，从而产生耐药，在获得性耐药患者中，突变率约占50%。因此，分析肺癌患者EGFR突变谱具有重要的临床意义。研究表明，肺癌患者中，EGFR突变率与临床特征和病理分型有关，女性、肺腺癌、多发转移患者，EGFR基因突变率更高；而年龄、肿瘤病理分级和临床分期则与EGFR基因总突变率有显著相关性[4]。另外，不同地区由于遗传、环境和生活习惯不同，患者的EGFR突变率可能会受到影响[5-6]。但不同地区和人群的EGFR基因突变谱的临床特征目前研究尚不完善，传统检测技术对复合突变的检出率低，需要高通量的检测技术进行数据积累、研究和补充。临床靶向治疗中，携带不同EGFR分子分型的肺癌患者，对临床靶向治疗的影响不同，因此，急需EGFR基因分子分型的相关临床研究，为肺癌分子诊断和靶向治疗方案制定提供参考依据。

本文拟采用二代测序技术，检测来自河南地区肺癌样本中的EGFR基因突变，分析EGFR基因突变分型在肺癌中的典型特征，从而阐述EGFR基因突变谱和分子分型的临床特征和意义，探讨EGFR基因突变分型在肺癌辅助诊断和病理分型中的可能性，为肺癌的临床诊断和靶向治疗提供精准的基因参考信息。

1 资料与方法

1.1临床资料 对2019年7月至2021年2月采集的895例肺癌患者样本进行回顾性分析。患者均确诊为肺癌，登记患者性别、年龄、病理分型、临床症状、是否转移等基本资料。样本和患者资料来自河南省41个县市的134家医院，通过第三方医检公司郑州金域临床检验中心汇总检测。本研究通过金域医学伦理委员会审核，研究程序符合伦理要求。

1.2试剂与方法 福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，经病理苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察视野内肿瘤细胞数占20%以上，并划分刮取肿瘤细胞范围，提取肿瘤DNA样本。使用凯杰试剂盒(货号：56404)采集血浆，血浆样本体积要求2～4 mL。使用凯杰试剂盒(货号：55184)提取血浆循环游离DNA(cfDNA)样本。采用二代测序方法检测已提取DNA中的EGFR全外显子和部分内含子区域的点突变和小片段插入/缺失、剪切子变异、拷贝数变异突变。其中使用到KAPPA构库试剂、IDT定制靶向探针、Illumina上机试剂(货号：FC-404-2004)。结果经生物信息分析，采用bwa(0.7.10-r789)+Picard(v 1.128)+Genome Analysis Toolkit(GATK v3.5)等工具将测序原始数据转变成易存储、易理解的变体调用格式(vcf)，得出突变结果注释表。依据美国《医学遗传学与基因组学学会解读标准和分子病理报告指南》，参考肿瘤数据库和人群数据库，对结果注释表进行人工分析和突变结果分类筛选。数据质控指标：Q30>0.85，捕获特异性大于65%，靶向区域覆盖度大于99%，去重后深度大于500X的靶向区域大于90%。要求检测突变灵敏度达到0.5%。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率(%)表示，采用χ2检验、连续校正χ2检验和Fisher确切概率法分析检出率之间的统计学差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1样本特征 895例肺癌患者中年龄23～91岁，年龄中位数67岁，不同年龄段数量分布见图1。肺癌患者中肺腺癌315例，肺鳞癌40例；多发转移性28例，肺占位42例，胸腔积液10例。按样本类型分，共收集FFPE组织样本779例，血浆样本116例。

图1 895例肺癌患者年龄特征

2.2.1不同临床诊断组EGFR分型突变率比较 不同临床诊断组的EGFR基因分子分型突变率与肺癌总突变率进行纵向结果对比统计见表1。组1中EGFR总突变率和各突变分型突变率与肺癌总体比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。组2中EGFR基因总突变率，T790M、20INS 2个分型的突变率与肺癌总体比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，但L858R、19DEL、EGFR扩增3个分型的突变率与肺癌总体比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。组3中EGFR总突变率和L858R、T790M 2个分型的突变率与肺癌总体比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，19DEL、20INS、EGFR扩增3个分型的突变率与肺癌总体比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。组4中EGFR基因总突变率和各基因突变型的阳性率与肺癌总体比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同临床诊断组EGFR分型突变率比较[ n(%)]

2.2.2不同病理分型组EGFR分型突变率比较 肺腺癌组EGFR总突变率和L858R、19DEL 2种分型的突变率与肺鳞癌组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，且肺腺癌突变率高于肺鳞癌组；T790M突变在肺鳞癌组中无阳性样本。肺腺癌组20INS、EGFR扩增分型突变率与肺鳞癌组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。无统计学差异的2种突变分型均为EGFR-TKI耐药机制。见表2。

表2 不同病理分型组EGFR分型突变率比较[ n(%)]

2.2.3不同性别组EGFR分型突变率比较 不同性别组间EGFR基因总突变率，L858R、19DEL、20INS、T790M 4种分型突变率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，女性突变率均高于男性。不同性别组间EGFR扩增突变率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同性别组EGFR分型突变率比较[ n(%)]

2.2.4不同标本类型组EGFR分型突变率比较 血浆cfDNA组EGFR基因总突变率和各分子分型突变率与组织FFPE组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。 组织FFPE组的总阳性、L858R、19DEL、扩增4种分型突变率略高于血浆cfDNA组，而20INS、T790M 2种分型突变率略低于血浆cfDNA组。见表4。20INS、T790M均为EGFR-TKI耐药突变。拷贝数扩增的检测，需要样本中具有较为完整的DNA片段。分析突变频率不同的原因可能跟标本临床治疗阶段和标本DNA的完整度有关。

表4 不同标本类型的EGFR分型突变率比较[ n(%)]

2.3肺癌不同临床组的EGFR基因突变数目分类特征 (1)按单突变和复合突变，肺腺癌和肺鳞癌的突变分型计数见表5。(2)按单突变和复合突变，有明确临床诊断特征的EGFR突变阳性肺癌患者的突变类型统计数目见表6。

表5 肺腺癌和肺鳞癌突变分型计数表

续表5 肺腺癌和肺鳞癌突变分型计数表

表6 肺癌临床组EGFR基因突变数目分类计数表

3 讨 论

EGFR是肺癌中首个具有临床意义的驱动基因，携带EGFR特定突变的肺癌患者，可能从靶向治疗中获益，从而延长该类患者的无进展生存期。本研究结果，河南地区895例肺癌患者EGFR突变率为53.97%，国内已有报道的各地区肺癌患者EGFR基因突变率为20%～60%，主要影响因素可能有检测技术、研究人群、地区和遗传等[5-8]。本研究结果表明，在EGFR的总突变率方面，女性肺癌患者高于男性，肺腺癌高于肺鳞癌，中高分化肺癌高于低分化肺癌，与已有研究结果一致[7-9]。同时，本研究发现，EGFR扩增在性别之间及肺腺癌和肺鳞癌之间均无统计学差异，提示EGFR基因突变率较低的男性或肺鳞癌患者，可关注EGFR扩增，寻找新的诊断治疗方案。另外，本研究还发现EGFR分子分型在不同的患者和标本类型中有不同的分布特征。

3.1不同临床诊断组EGFR分子分型特征 EGFR分子分型在不同的临床诊断组中有不同的分布特征。HAYASHI等[10]研究表明，转移性、侵袭性肿瘤中EGFR突变率较高，并可能常与EGFR基因复合突变同时出现，本研究肺癌多发转移组中，EGFR基因突变率比肺癌总体和其他临床组更高，同时，单突变和复合突变发生数目最多的均为转移性肿瘤组，与HAYASHI等[10]研究一致。本研究肺癌转移患者的EGFR基因突变分型特征，表现在L858R、19DEL、EGFR扩增3个分型的突变频率比肺癌总体突变频率高，L858R、19DEL为EGFR-TKI敏感突变，EGFR扩增可能导致EGFR蛋白过表达，文献报道其可能是EGFR-TKI治疗的不利因素，需要在治疗中增加EGFR单抗类药物[11-12]。提示检测EGFR基因突变的同时，检测EGFR扩增，可帮助肺癌转移患者靶向治疗制定全面的治疗方案。

肺癌胸腔积液在晚期NSCLC患者的初诊发生率为10%～15%，晚期NSCLC患者的胸腔积液与EGFR基因突变率有相关性[13]。本研究胸腔积液组EGFR基因突变率较高，与肺癌总体相比，有统计学差异的突变为L858R和T790M。T790M突变为一代和二代EGFR-TKI耐药突变，三代EGFR-TKI敏感突变多为继发突变，是常见的肺癌耐药因素，也是更改靶向治疗方案的主导因素。

3.2不同病理类型组EGFR分子分型特征 肺鳞癌和肺腺癌之间，EGFR基因突变分型特征主要体现在EGFR基因L858R和19DEL在肺腺癌中突变率较高，而EGFR基因扩增突变率在肺鳞癌中与肺腺癌中无统计学差异。PI等[14]研究了晚期肺腺癌中EGFR基因突变，所有突变类型中EGFR 19DEL基因突变率占50.7%，21号外显子L858R基因突变率占43.4%，本研究结果与之接近。肺鳞癌中EGFR拷贝数扩增的突变率较高，其机制尚不明确。临床数据表明，EGFR扩增的NSCLC患者生存时间较无EGFR扩增的患者短，但其与患者预后的相关性有待进一步研究[7]。另外，有文献报道，在早期肺癌、腺癌及非吸烟的女性患者中，EGFR 基因外显子突变常同时伴有EGFR基因的扩增[15]，本研究中，EGFR突变伴随扩增，主要发生在肺腺癌中，占复合突变总数的40.62%(13/32)，可能与肺癌进展有关，而肺鳞癌中EGFR扩增以单突变为主。

3.3不同性别组EGFR分子分型特征 对比不同性别组间突变分型阳性率，L858R/19DEL/20INS均有显著差异，且女性较高，而T790M/扩增无统计学差异，EGFR基因扩增在男性中的数量高于女性。可知，男性和女性有不同的EGFR基因突变分型特征，EGFR突变阴性的男性肺癌患者可关注EGFR基因扩增的检测，扩大靶向治疗指导用药范围。

3.4不同标本类型组EGFR分子分型特征 液体活检主要针对cfDNA和循环肿瘤细胞(CTCs)。其中cfDNA是肺癌中研究最多、被广泛采用的肿瘤基因分型来源，已经进入了检测敏感和耐药EGFR突变的临床实践。近几年，通过下一代测序进行更全面的血浆基因分型已被应用于临床，并从晚期/转移性疾病转移到新的前沿，如早期检测和微小残留病灶评估[16]。一项AURA试验的回顾性分析结果表明，液体活检的EGFR基因突变与组织活检的阳性一致性为61%[17]，但本研究血浆标本和组织标本总突变率和各突变分型之间无统计学差异。分析原因可能是临床有选择性送检，血浆样本主要来源为转移性肺癌和耐药后基因监测，因而EGFR突变率升高，另外，高通量测序技术(NGS)的使用提高了检测的灵敏度，可能检出cfDNA中的低频突变，使EGFR突变率升高。从EGFR分子分型来看，本研究cfDNA样本比FFPE样本中的T790M突变率高，但拷贝数扩增和19DEL突变率较低，提示游离血浆中DNA碎片化，可能影响小片段扩增或缺失突变的检测。

EGFR基因检测在肺癌临床中主要用于指导靶向治疗，但其突变分型特征和临床应用价值尚缺少强有力的临床研究。本文阐述了河南地区EGFR基因突变分型的突变率特征，结果表明，不同患者有不同的EGFR突变分型特征，同时，NGS检测EGFR突变分型具有检测面广、灵敏度高、可同时检测多种突变类型等优势，游离血浆也可作为组织样本的有效补充。但本研究缺少临床治疗相关资料，未来还需临床治疗数据对EGFR分子分型的临床意义进行验证。