肺炎克雷伯菌RAPD基因分型及其与氨基糖苷类药敏分型对比研究

罗灿，陈昕怡，王敏*，李先平，李采霞（. 中南大学湘雅二医院检验科，长沙 400；. 中国人民解放军联勤保障部队第 904 医院（无锡市太湖医院）生殖中心，江苏 无锡 4044）

肺炎克雷伯菌（KPN）是常见的医院机会致病菌，可引起肺炎、肝脓肿、泌尿系统感染、败血症、创伤感染、脑膜炎等感染。2017年中国细菌耐药监测网（CHINET）的数据显示，KPN在我国临床菌株分离率中居第二位（14.68%），仅次于大肠埃希菌（19.27%）。据文献报道，氨基糖苷类药物可以作为临床经验治疗KPN感染的首选用药。以氨基糖苷类药敏分型为代表的表型分型，简便快速，能较好地指导临床用药。但药敏分型仅据表型特征进行分类，无法满足从基因水平上发现菌株之间的联系和变异来追踪感染源的要求。对KPN进行基因分型，了解其感染的分子流行病学是医院感染分析的重要任务。作为KPN基因分型技术之一，RAPD分型快速、简便、经济、多态性检出率高、可自动化分析，可在DNA水平上反映生物品种鉴定、系谱分析、追溯生物同源性。本文采用RAPD技术对临床分离的82株KPN进行基因分型，并与氨基糖苷类药敏分型进行对比分析，为追溯KPN的同源性，防止KPN的克隆性传播以及指导临床KPN的治疗提供依据。

1 材料

1.1 菌株

收集中南大学湘雅二医院2016年8月至2017年2月住院患者临床标本中分离的非重复KPN 82株，分离自痰标本、粪便标本、尿液标本、血液标本、分泌物标本和咽拭子标本。标本主要分布于ICU、呼吸内科、新生儿科、神经外科等病区。菌株均经Phoenix 100全自动细菌鉴定系统鉴定后再按第九版伯杰氏细菌鉴定手册要求确认。

1.2 试药和仪器

MasterMixPCR扩增试剂、DNA Marker I（100-600bp）、细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；Phoenix 100全自动细菌鉴定系统（美国BD公司）；PCR扩增仪（美国应用生物系统公司）；JY300C型电泳仪（北京君逸东方电泳设备有限公司）；FluorChem FC2凝胶成像系统（美国Alpha Innotech 公司）。

1.3 RAPD引物

引物序列RAPD 1（5'-GGGATGGAAC-3'）、RAPD 2（5'-AAGAGCCCGT-3'）、RAPD 3（5'-AACGCGCAAC-3'）和OPA 2（5'-TGCCGAGCTG-3'）均由上海生工生物工程技术有限公司合成。

2 方法

2.1 细菌的培养及鉴定

分离的肺炎克雷伯菌经Phoenix 100全自动细菌鉴定系统鉴定后再按第九版伯杰氏细菌鉴定手册要求确认。该系统进行鉴定的同时自动生成对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的药敏结果。按照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的氨基糖苷类药敏结果判断标准判定结果。

2.2 细菌DNA提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取肺炎克雷伯菌DNA。

2.3 RAPD扩增

RAPD扩增反应总体系为20 μL：DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 10 μL，引 物2 μL，ddHO 7 μL。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，32℃退火2 min，72℃延伸2 min，共45个循环，最后72℃延伸15 min。取5 μL RAPD产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（80 V·cm×0.5 h），凝胶成像系统观察并拍照。观察电泳条带的数目、位置、荧光强弱进行RAPD分型。结果判读：条带完全相同或1条/2条不同判定为同一克隆株。

2.4 RAPD基因分型相符程度计算

RAPD分型两两比较最高相符程度（%）＝（对比RAPD分型所占比例最高者菌株数/标准RAPD分型主要型别菌株数）×100%；氨基糖苷药敏分型结果与RAPD分型结果最高相符程度（%）＝（氨基糖苷类药敏分型所占比例最高者/RAPD分型主要型别相同菌株数）×100%；RAPD分型与氨基糖苷类药敏分型结果对比最高相符程度（%）＝（每种RAPD引物所得分型结果中所占比例最高者/氨基糖苷类药敏分型型别相同菌株数）×100%。

3 结果

3.1 KPN氨基糖苷耐药及药敏分型情况

82株KPN对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率分别为19.51%（16/82），64.63%（53/82），41.46%（34/82）（见表1）。

表1 82株KPN氨基糖苷类药敏结果
Tab 1 Aminoglycoside resistance and antimicrobial susceptibility of 82KPN

注：R代表耐药，M代表中介，S代表敏感。
Note：R for resistance，M for middle，S for susceptibility.

菌株数 抗菌药物 药敏分型阿米卡星 庆大霉素 妥布霉素16 23 21 14 41111 RSSSSSSMS RSRRSSMRR RSSRRMSMM①②③④⑤⑥⑦⑧⑨耐药率 19.51% 64.63% 41.46%

82株KPN经氨基糖苷药敏分型可分为9种（①～⑨），其中①型占19.51%（16/82），②型占28.05%（23/82），③型占25.61%（21/82），④型占17.07%（14/82）（见图1）。

图1 82株KPN氨基糖苷药敏分型Fig 1 Aminoglycoside typing of 82 KPN

3.2 KPN RAPD分型情况

82株KPN经RAPD扩增条带数目多在1～7条，形成的图谱清晰，带型稳定，多态性丰富。实验菌株用RAPD 1引物分为20（A～T）种，以C型（25.61%，21/82）为主，其次为D型（15.85%，13/82）以及B型（14.63%，12/82）；用RAPD 2分为22（a～v）种，以b型（37.80%，31/82）为主，其次为e型（7.32%，6/82）以及a型（6.10%，5/82）；用RAPD 3分为17（Ⅰ～ⅩⅦ）种，以Ⅰ型（42.68%，35/82）为主，其次为Ⅱ型（17.07%，14/82）以及Ⅳ型（8.54%，7/82）；用OPA 2分为17（[1]～[17]）种，以[4]型（28.05%，23/82）为主，其次为[3]型（18.29%，15/82）以及[2]型（13.41%，11/82）。各引物扩增产物电泳条带分型结果见图2～5。

图2 82株KPN的RAPD 1基因分型Fig 2 RAPD 1 genotyping of 82 KPN

图3 82株KPN的RAPD 2基因分型Fig 3 RAPD 2 genotyping of 82 KPN

图4 82株KPN的RAPD 3基因分型Fig 4 RAPD 3 genotyping of 82 KPN

图5 82株KPN的OPA 2基因分型Fig 5 OPA 2 genotyping of 82 KPN

3.3 KPN引物间RAPD分型比较

将RAPD 1与RAPD 2，RAPD 1与RAPD 3，RAPD 1与OPA 2，RAPD 2与RAPD 3，RAPD 2与OPA 2，RAPD 3与 OPA 2引物在82株KPN中的基因分型结果进行两两比较，RAPD引物间基因分型相符程度从高到低依次为OPA 2与RAPD 2（65.22%）、RAPD 1与RAPD 3（57.14%）、OPA 2与RAPD 3（52.17%）、RAPD 2与OPA 2（48.39%）、RAPD 2与RAPD 3（35.48%）、RAPD 3与RAPD 1（34.29%）和RAPD 3与OPA 2（34.29%）等。OPA 2分型[4]型与RAPD 2分型b型相符度最高（65.22%，15/23），RAPD 1分型C型与RAPD 3分型Ⅰ型相符度次之（57.14%，12/21）。4种引物扩增结果对比见表2。

表2 4种引物间RAPD分型对比
Tab 2 RAPD typing of 4 primers

标准RAPD分型 对比RAPD分型引物 型别 株数 引物 最高相符程度/% 基因型（个数）RAPD 1 C 21 RAPD 2 23.81 a（2）b（5）c（1）d（1）e（5）l（3）i（1）j（1）r（2）RAPD 1 C 21 RAPD 3 57.14 Ⅰ（12）Ⅱ（2）Ⅲ（1）Ⅳ（3）Ⅸ（1）ⅩⅥ（1）ⅩⅦ（1）RAPD 1 C 21 OPA 2 33.33 [2]（2）[3]（4）[4]（7）[5]（1）[6]（2）[10]（1）[12]（2）[14]（2）RAPD 2 b 31 RAPD 1 22.58 B（7）C（5）D（5）E（1）J（3）N（1）O（5）P（2）S（2）RAPD 2 b 31 RAPD 3 35.48 Ⅰ（11）Ⅱ（8）Ⅲ（1）Ⅳ（5）Ⅴ（1）Ⅵ（1）Ⅶ（1）Ⅷ（1）Ⅻ（1）ⅩⅣ（1）RAPD 2 b 31 OPA 2 48.39 [1]（1）[2]（3）[3]（4）[4]（15）[5]（2）[9]（1）[10]（4）[16]（1）RAPD 3 I 35 RAPD 1 34.29 A（1）B（3）C（12）D（4）E（1）G（2）H（1）Ⅰ（2）J（2）N（1）O（4）S（2）RAPD 3 I 35 RAPD 2 31.43 A（5）b（11）d（3）e（7）h（1）i（2）j（2）m（1）n（1）o（1）q（1）RAPD 3 I 35 OPA 2 34.29 [1]（4）[2]（4）[3]（5）[4]（12）[5]（3）[6]（2）[10]（4）[16]（1）OPA 2 [4] 23 RAPD 1 26.09 B（5）C（6）D（1）E（1）H（1）J（2）M（1）N（1）O（1）P（2）S（2）OPA 2 [4] 23 RAPD 2 65.22 a（1）b（15）e（1）j（2）n（2）o（1）u（1）OPA 2 [4] 23 RAPD 3 52.17 Ⅰ1（2）Ⅱ（4）Ⅲ（1）Ⅳ（4）Ⅶ（1）Ⅷ（1）

3.4 RAPD分型和氨基糖苷药敏分型对比分析

以RAPD分型为标准分型（见表3），RAPD 2分型b型（12株）与氨基糖苷药敏分型②型（31株）的相符度最高（38.71%，12/31），OPA 2分型[4]型与药敏分型③型的相符度次之（34.78%，8/23）。以药敏分型为标准分型（见表4），对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素 3种抗生素全耐药型（①型）与RAPD 3分型I型的相符度最高（62.50%，10/16），对3种药物均敏感型（②型）与RAPD 2分型b型的相符度较高（52.17%，12/23）。

表3 RAPD分型结果与药敏结果对比(以RAPD分型为标准)
Tab 3 RAPD typing and aminoglycosides typing (with RAPD typing as standard)

RAPD分型 氨基糖苷类药敏分型引物 型别 株数 最高相符程度/% 分型（个数）RAPD 1 C 21 28.57 ①（4）②（6）③（4）④（4）⑤（1）⑥（1）⑧（1）RAPD 2 b 31 38.71 ①（6）②（12）③（6）④（5）⑤（1）⑦（1）RAPD 3 I 35 28.57 ①（10）②（10）③（9）④（4）⑥（1）⑨（1）OPA 2 [4] 23 34.78 ①（3）②（7）③（8）④（4）⑥（1）

表4 氨基糖苷类药敏分型结果与RAPD分型结果对比(以RAPD分型为标准)
Tab 4 Aminoglycosides typing and RAPD typing (with RAPD typing as standard)

氨基糖苷类药敏分型 RAPD分型型别 株数 引物 最高相符程度/% 基因型（个数）① 16 RAPD 1 31.25 A（1）C（4）D（5）G（1）H（1）L（1）O（1）S（1）T（1）① 16 RAPD 2 37.50 a（2）b（6）e（3）k（1）m（1）o（1）r（1）v（1）① 16 RAPD 3 62.50 Ⅰ（10）Ⅱ（1）Ⅲ（1）Ⅴ（1）Ⅸ（1）ⅩⅣ（1）ⅩⅥ（1）① 16 OPA 2 25.00 [1]（1）[2]（1）[3]（4）[4]（3）[5]（1）[6]（1）[7]（1）[10]（1）[14]（1）[16]（1）[17]（1）② 23 RAPD 1 26.09 A（1）B（4）C（6）D（3）E（2）G（1）H（1）J（1）N（1）O（1）P（1）Q（1）② 23 RAPD 2 52.17 a（4）b（12）d（1）e（3）g（1）i（1）q（1）② 23 RAPD 3 43.48 Ⅰ（10）Ⅱ（4）Ⅳ（4）Ⅴ（2）Ⅵ（1）Ⅶ（1）Ⅷ（1）② 23 OPA 2 30.43 [1]（1）[2]（4）[3]（5）[4]（7）[5]（2）[9]（1）[10]（3）③ 21 RAPD 1 28.57 A（1）B（6）C（4）D（4）F（1）I（2）O（2）R（1）③ 21 RAPD 2 28.57 b（6）e（1）f（1）h（1）i（1）j（2）l（3）n（2）o（1）q（1）s（1）t（1）③ 21 RAPD 3 42.86 Ⅰ（9）Ⅱ（3）Ⅳ（1）Ⅴ（2）Ⅹ（1）Ⅺ（1）ⅩⅤ（1）ⅩⅥ（1）ⅩⅦ（2）③ 21 OPA 2 38.10 [2]（2）[3]（2）[4]（8）[5]（1）[6]（1）[8]（1）[10]（3）[12]（2）[15]（1）④ 14 RAPD 1 28.57 B（2）C（4）D（1）I（1）J（2）K（1）M（1）O（1）R（1）④ 14 RAPD 2 35.71 b（5）d（1）e（2）i（1）n（1）p（1）q（1）r（1）u（1）④ 14 RAPD 3 35.71 Ⅰ（4）Ⅱ（5）Ⅲ（2）Ⅳ（2）Ⅻ（1）④ 14 OPA 2 28.57 [1]（2）[2]（2）[3]（3）[4]（4）[6]（1）[10]（1）[11]（1）⑤ 4 RAPD 1 25.00 C（1）D（1）J（1）L（1）⑤ 4 RAPD 2 50.00 b（1）g（1）l（2）⑤ 4 RAPD 3 25.00 Ⅴ（1）Ⅸ（1）Ⅻ（1）ⅩⅤ（1）⑤ 4 OPA 2 25.00 [2]（1）[10]（1）[12]（1）[13]（1）

4 讨论

KPN是院内感染的常见病原体之一，其引起的高感染率和高病死率已成为全球关心的公共卫生问题。近年来KPN对不同种类抗菌药物的耐药率呈逐年上升的趋势。据统计，在2005－2014年间，KPN对第3代头孢菌素耐药率从20%上升到80%～90%，氟喹诺酮类药物耐药率从40%上升到60%左右，其他抗菌药物的耐药率也有不同程度的升高。本实验82株KPN对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐药率较高，分别为19.51%、64.63%、41.46%，与相关报道一致。氨基糖苷耐药KPN的流行和传播使KPN的控制变得愈加困难，对菌株的正确分型是进行细菌流行病学及抗菌药物研究的关键。判定传播关系中病原菌的基因型是否一致仍是分子流行病学的重要任务。目前基因分型的方法主要包括RAPD、MLST、PFGE等。PFGE是分子分型方法的金标准，具有分型能力强，结果容易判断和重复性好等优点；MLST能够分析不同时间不同地区临床分离株的遗传相关性；但两者实验条件要求高，操作复杂，费用昂贵。RAPD采用一条随机通用引物，通过对基因组DNA扩增所得带型来进行分型，能直接对各种微生物DNA进行分析，可作为一种快速的筛查手段和方法。

本实验中82株KPN采用RAPD 1引物分为20种（A～T型）；用RAPD 2分为22种（a～v型）；用RAPD 3分为17种（Ⅰ～ⅩⅦ型）；用OPA 2分为17种（[1]～[17]型）。KPN的基因多态性分布可能与菌株的来源以及RAPD技术灵敏度高有关。本实验结果表明部分菌株表现为同一RAPD型，说明本院KPN确实存在一定程度的克隆性传播。虽然4种RAPD引物都可以有效地对KPN进行基因分型，但是4种引物的分型能力存在差异，其中RAPD 2和OPA 2的分型能力强于RAPD 1和RAPD 3。

本实验比较了4种引物RAPD分型的相符程度。4种引物间RAPD分型结果比较中，与其他3种RAPD引物分型结果相符程度最高的为OPA 2引物，结合上文所述的RAPD 2和OPA 2的分型能力强于RAPD 1和RAPD 3，提示OPA 2为本实验室KPN进行RAPD分型的最优引物。总体来说，4种引物间的分型相符程度并不高，原因可能是RAPD引物只能扩增与之特异结合的基因组DNA，反映部分基因组信息，造成结果片面。翟平平等用20条随机引物对4株肠出血性大肠埃希菌进行3轮RAPD实验，只有5条引物扩增图谱得到较稳定的结果，其余引物出现无扩增条带、稳定性较差等问题。这与本实验结果共同说明选择合适的引物以及对RAPD反应体系进行优化是保证RAPD可靠度的前提。

本实验中RAPD扩增所得分型结果多于氨基糖苷类耐药分型，且RAPD分型和氨基糖苷类药敏分型结果不完全一致，这与相关报道一致。在本实验中，同一种RAPD分型包含的菌株对应多种氨基糖苷类药敏表型，RAPD 2和OPA 2分型与药敏结果相符程度较高，可能原因是在抗菌药物的作用下，基因型相同的菌株表型发生了改变。此外，耐药表型相同的菌株基因型不一定相同，提示氨基糖苷耐药表型受多种遗传因子的综合影响。其中相符程度最高的是①型（AMK、GEN和TOB全耐药）与RAPD 3分型I型（62.50%，10/16），其次是②型（AMK、GEN和TOB全敏感）与RAPD 2分型b型（52.17%，12/23）。这表明RAPD 3、RAPD 2分别对氨基糖苷类药物全耐药、全敏感的KPN进行基因分型的特异度较高，提示在已知KPN的氨基糖苷类药敏分型时，可选择相应RAPD引物进行基因分型，以便追溯菌株同源性。

本实验验证了RAPD技术是一种快速敏感、结果清晰、多态性好的分型方法，建立了适用于本实验室的KPN的RAPD分型方法，提示选择合适的分型引物是RAPD正确分型的重要影响因素。就本实验室而言，OPA 2是最优引物，而对氨基糖苷类药物全耐药、全敏感的KPN进行RAPD分型时应分别选择RAPD 3、RAPD 2引物。