共同性外斜视眼外肌MYH13水平与病理形态学及预后的关系研究

杨 英，王 炜，马芳芳

(新疆军区总医院北京路医疗区眼科三病区，乌鲁木齐 830013)

斜视是眼科常见疾病之一，也是引发双眼视觉功能障碍最常见原因，其发病率高，为3%～5%，严重影响患者生活与工作[1]。共同性斜视是斜视最常见类型，其斜视角度不因注视方向、注视眼别的改变而变化，其发病率约占斜视总发病率的80%[2]。共同性斜视临床常用治疗方法有保守治疗与手术治疗，而手术治疗是其第一治疗方案，可达到功能性治愈目的[3]。有研究发现，斜视眼外肌中一些基因表达变化与肌纤维形态、数量等相关，肌球蛋白重链13基因(myosin heavy chain gene 13，MYH13)在眼外肌中表达，在眼外肌高速扫视收缩中发挥重要作用[4]。但关于MYH13在共同性外斜视患者眼外肌中表达的研究较少，因此，本研究初步探讨MYH13与共同性外斜视患者眼外肌病理形态学及预后的关系，旨在为其治疗及分子机制研究提供参考资料，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2018年10月本院眼科收治的86例行斜视矫正术治疗的共同性外斜视患者作为研究对象(斜视组)，依据眼外肌(内直肌)中MYH13 mRNA水平中位数分为MYH13高表达组和MYH13低表达组。纳入标准：(1)符合共同性外斜视诊断标准[5]；(2)双眼球各方向运动不受限；(3)第一、二斜视角相等；(4)年龄大于1岁；(5)患者及家属知情，签署知情同意书；(4)经本院伦理委员会审核批准。排除标准：(1)智力发育障碍，无法配合检查者；(2)有眼部手术史者；(3)伴眼部器质性病变者；(4)高度近视、远视、弱视、屈光参差大于2.00 D及散光者；(5)垂直斜视者；(6)合并神经系统疾病者；(7)全身器质性疾病者；(8)术后随访资料不完整者。共同性外斜视组男39例，女47例，年龄3～28岁，平均(11.89±3.42)岁；发病年龄1.3～7.8岁，平均(3.50±1.10)岁；病程3.2～11.6年，平均(5.46±1.13)年，外斜视度数45°～90°，平均(67.50±8.50)°。另选取28例因外伤所致需眼球摘除患者(无斜视)的眼外肌(内直肌)作为对照组，其中男13例，女15例；年龄7～32岁，平均(13.18±3.13)岁；19例为眼球破裂，9例为眼球贯通伤。斜视组和对照组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1眼外肌MYH13 mRNA表达检测

采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测MYH13 mRNA表达，MYH13引物序列：上游为5′-TGA CCG CAG CAT CTC TAG GAA GAC G-3′，下游为5′-TTC CGG AGG TAG GGA GCT GCT TC-3′，内参基因GAPDH引物序列：上游为5′-CCC GCT TCG CTC TCT GCT CC-3′，下游为5′-ACC AG G CGC CCA ATA CGA CC-3′。Trizol(美国Invitrogen公司)法提取总RNA，逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)合成cDNA，qRT-PCR试剂盒(日本TAKARA公司)配制反应体系，进行PCR扩增，采用2-ΔΔCT方法计算眼外肌MYH13 mRNA相对表达水平。

1.2.2眼外肌MYH13蛋白水平检测

提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取蛋白于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将目的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加山羊抗MYH13(美国Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH，分别加入辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊、鼠抗兔二抗，ECL染色，胶片曝光，显影，定影，计算MYH13蛋白表达水平。

1.2.3眼外肌病理形态学检查

取眼外肌标本，常规脱水，石蜡包埋，制作厚度3 μm眼外肌纵向切片，切片进行二甲苯脱蜡，酒精脱水，苏木精染色，盐酸乙醇分化，伊红染色，脱水、透明，封片；采用Olympusl X50倒置显微镜与PM304曝光控制系统观察苏木精-伊红(HE)染色图片及纤维照相，高倍镜下随机取5个视野，计算肌纤维数量，以平均数作为每例标本肌纤维含量；采用Motic Med6.0图片分析系统测量肌细胞的横截面积，每张切片随机测量20个肌细胞，取平均数。

1.2.4术后视觉三级功能检测

采用同视机和Titmus立体图检测患者视觉3级功能，Ⅰ级同时视：采用猴子和熊猫图片检测有无同时视；Ⅱ级融合功能：在Ⅰ级基础上用猫捉蝴蝶图片检测有无融合功能和融合范围；Ⅲ级立体视：采用Titmus立体图检测近距离立体视情况，患者配戴偏振光镜片，观察不同级别圆环图，记录患者能否分辨出凹凸层次感的最小视差，≤60″者记为立体视功能正常，>60″者即无正常立体视。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 斜视组和对照组眼外肌MYH13 mRNA表达水平比较

斜视组眼外肌MYH13 mRNA相对表达水平为0.21±0.06，对照组为0.79±0.20，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

M：Marker；a：对照组；b：斜视组。

图2 qRT-PCR扩增曲线图

2.2 斜视组和对照组眼外肌MYH13蛋白水平比较

斜视组眼外肌MYH13蛋白水平为0.19±0.05，对照组为0.71±0.15，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 斜视组和对照组眼外肌MYH13蛋白表达

2.3 MYH13水平与共同性外斜视患者内直肌病理形态的关系

MYH13高表达组内直肌肌纤维平均横截面积、肌纤维含量高于MYH13低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图4。

表1 斜视组内直肌病理形态学比较

A：MYH13高表达组；B：MYH13低表达组；箭头：肌纤维。

2.4 眼外肌MYH13水平与共同性外斜视患者术后斜视度数比较

术后6个月，MYH13高表达组斜视度数明显低于MYH13低表达组[4(2，5)°vs.9(5，12)°],差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 眼外肌MYH13水平与共同性外斜视患者术后视觉三级功能的关系

术后6个月，MYH13高表达组同时视、融合范围、立体视高于MYH13低表达组(P<0.05)，两组融合功能比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 斜视组术后视觉三级功能比较

3 讨 论

共同性斜视以双眼视觉不稳定或未巩固完善的儿童多见，6岁前多发，3岁内为发病最集中年龄段，发病率为0.43%～1.70%，而12岁后发病率明显降低[6]。在儿童时期，斜视可导致出现弱视、双眼障碍等不可逆性的视觉中枢缺陷，成人期发病，则可导致复视发生[7]。斜视不仅导致患者双眼视觉功能障碍，还影响患者面部美感，同时给患者造成严重心理创伤。因此，寻找该病发病机制及有效治疗方法成为医学研究的热点。

眼外肌是控制眼球运动的肌肉，由4条直肌与2条斜肌组成，有较强的收缩性与抗疲劳性，眼外肌的横纹肌的低张力、高速度的收缩特性和眼外肌型肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)的表达密切相关，而眼外肌型MHC主要由MYH13编码[8-9]。MYH13是人类17号染色体快速/发育MYH基因簇的重要成员之一，也是祖先骨骼肌与心肌肌球蛋白分化后在快速/发育簇中出现的第1个特异性肌球蛋白，具有物种间高度保守性，对眼外肌收缩特性有重要调控作用[10]。CHENG等[11]对黑暗饲养大鼠和单眼剥夺的猴子模型进行研究发现，眼外肌转录组发生改变，在斜视、弱视及先天性白内障模型中MYH13表达受到抑制，导致视觉运动发育不良。田亮等[12]研究发现，共同性内斜视患者眼外肌MYH13表达缺失，在其发生、发展中发挥重要作用。本研究结果显示，共同性外斜视组眼外肌MYH13 mRNA水平与蛋白水平表达均低于对照组，与上述结果相似，提示共同性外斜视患者眼外肌MYH13低表达。研究发现，共同性外斜视患者内直肌肌纤维横截面积明显减小，肌纤维数量减少，排列紊乱及胶原纤维增生等病理性改变[13]。本研究结果显示，MYH13高表达组内直肌肌纤维平均横截面积、肌纤维含量高于MYH13低表达组，提示MYH13高表达共同性外斜视患者内直肌病变程度较轻，推测MYH13高表达可能有利于内直肌中肌球蛋白维持在较高水平，有利于内直肌结构及功能维持[10]。

斜视是造成双眼视觉功能异常最主要疾病之一，斜视和双眼视觉功能之间的关系一直是医学研究的热点[14]。双眼视觉是最完善的高级视觉功能，主要分为同时视、融合功能及立体视三级[15-16]。斜视不仅能对儿童时期双眼视觉造成影响，同时也可破坏发育成熟的双眼视觉，双眼视觉功能的恢复及重建是斜视治疗的首要目的，也是术后预后评定的重要指标之一[17-18]。本研究结果显示，术后6个月，MYH13高表达组共同性外斜视患者斜视度数低于MYH13低表达组，同时视、融合范围、立体视均优于MYH13低表达组，提示MYH13高表达共同性外斜视患者术后斜视矫正效果较优，双眼视觉功能恢复较好，推测MYH13高表达可能有助于共同性外斜视患者眼外肌结构恢复，从而有利于其视觉功能恢复。

综上所述，共同性外斜视患者眼外肌MYH13 mRNA与蛋白水平均低表达，MYH13高表达患者内直肌肌纤维平均横截面积较大、肌纤维含量较高，有利于术后斜视度数矫正和双眼视觉功能恢复。然而本研究样本量较少，为单中心研究，且未对不同年龄段患者进行区分研究，可能会造成一定结果偏差，后续研究将扩大样本量、丰富类型进一步验证。