miRNA-124-3p抑制剂通过Wnt/β-catenin信号通路调节缺氧缺糖心肌细胞凋亡的研究*

2021-02-25 04:50马彦娟陈希妍石金河
重庆医学 2021年3期
关键词:心肌细胞抑制剂通路

马彦娟,任 芳,李 闯,陈希妍,杨 平,石金河

(新乡医学院第一附属医院急诊科,河南卫辉 453100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种严重的心脏疾病,是由于急性冠状动脉闭塞后导致的缺血缺氧而引起的心肌细胞死亡[1]。目前,大量研究表明在AMI心肌细胞功能受损和心力衰竭中,炎症和心肌细胞凋亡发挥重要作用[2]。miRNA是一类非编码的长度为19~25个核苷酸的短链RNA,其在细胞的多种功能调节,如分化、增殖、转移和凋亡等中发挥着重要作用[3]。研究显示miRNA-124在AMI患者血清中的表达升高[4],下调miRNA-124-3p可通过抑制心肌细胞凋亡而发挥对心肌梗死的保护作用[5]。还有研究表明,Wnt信号通路参与调节大鼠心肌梗死模型中的细胞凋亡[6]。miRNA-124-3p是否可通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥心肌细胞凋亡保护作用的研究还未见报道。本研究以H9C2细胞为研究对象,检测缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型中miRNA-124-3p抑制剂在调控Wnt/β-catenin信号通路中及细胞凋亡的可能作用,为心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基及胎牛血清(美国Gibco公司);Wnt1 siRNA、阴性对照(negative control,NC)siRNA(美国SANTA Cruz公司);miRNA-124-3p抑制剂(上海吉玛基因公司);Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司);Wnt1抗体、β-catenin抗体、p53抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体(美国SANTA Cruz公司);裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗体(美国Abcam公司);GAPDH抗体(美国Sigma公司);荧光Ⅱ抗(美国LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1H9C2的培养

大鼠心肌细胞H9C2细胞株(协和细胞库)培养于高糖DMEM培养基(内含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素及0.1 mg /mL链霉素),37 ℃、5% CO2恒温培养箱,2~3 d传代1次。

1.2.2OGD模型的建立及实验细胞分组

正常条件下培养的对数生长期的H9C2细胞,更换成无血清低糖DMEM培养基,1% O2、94% N2、5% CO2恒温培养箱培养48 h,形成OGD模型。细胞分为正常对照组、OGD组、NC-siRNA组(转染NC-siRNA后OGD条件培养48 h)、miRNA-124-3p抑制剂组(转染miRNA-124-3p抑制剂后OGD条件培养48 h)和Wnt1 siRNA组(转染Wnt-1 siRNA后OGD条件培养48 h)。

1.2.3心肌细胞转染

利用Lipofectamine2000转染试剂分别将miRNA-124-3p抑制剂、Wnt1 siRNA与NC-siRNA转染至H9C2细胞。

1.2.4心肌细胞活性的检测

将H9C2接种于无菌的96孔板中,密度为5×103个/孔,按照1.2.2方法将细胞分为5组,在OGD培养48 h后检测各组细胞活性,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃、5% CO2培养条件下继续孵育3 h,酶标仪450 nm处测光密度(A)值。

1.2.5Western blot

利用RIPA裂解液提取5组细胞总蛋白。常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及转膜后,室温条件下封闭膜1 h(利用5%脱脂奶粉),分别用Wnt1抗体(1∶1 000)、β-catenin抗体(1∶1 000)、p53 抗体(1∶500)、Bax抗体(1∶500)、Bcl-2抗体(1∶500)、cleaved-caspase-3抗体(1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶10 000)4 ℃条件下孵育膜过夜(12 h以上),室温避光条件下荧光Ⅱ抗(1∶1 000)孵育2 h,利用Odyssey曝光,Image J软件分析灰度值。

1.2.6ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6及IL-1β的水平

收集上述5组细胞的培养液,2 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液,采用ELISA法测定各组细胞培养液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA对Wnt1及β-catenin表达的影响

Western blot结果显示,与NC-siRNA组比较,miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组心肌细胞Wnt1及β-catenin表达水平明显降低(P<0.05),而NC-siRNA组与OGD组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图1、2。

1:正常对照组;2:NC-siRNA组;3:Wnt1 siRNA组;a:P<0.01,与NC-siRNA组比较。

1:正常对照组;2:NC-siRNA组;3:miRNA-124-3p抑制剂组;a:P<0.05,与NC-siRNA组比较。

2.2 各组心肌细胞活性比较

CCK-8结果显示,正常对照组心肌细胞的活性较高,而OGD组心肌细胞的活性明显降低(P<0.05);与OGD组比较,miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组细胞活性明显升高(P<0.05),而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组细胞活性比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图3。

2.3 各组p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白表达水平比较

与正常对照组比较,OGD组p53、Bcl-2蛋白表达水平降低,而Bax及cleaved-caspase-3的表达水平升高(P<0.05)。与OGD组比较,miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组p53、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax及cleaved-caspase-3表达水平降低(P<0.05),而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图4。

2.4 各组TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较

与正常对照组比较,OGD组TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05);与OGD组比较,miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组TNF-α、IL-6及IL-1β水平明显降低(P<0.05),而miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt1 siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

1:正常对照组;2:OGD组;3:NC-siRNA组;4:miRNA-124-3p抑制剂组;5.Wnt1 siRNA组;a:P<0.05。

表1 各组TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较

3 讨 论

AMI是当前临床上常见的缺血性心脏病之一,其发病机制较为复杂,研究表明炎症和心肌细胞凋亡参与介导心肌功能受损和心力衰竭,在AMI的发病机制中发挥重要作用[2,7]。

Wnt通路是一种进化保守的信号转导通路,在个体发育和成人期调控着多种细胞功能。AMI发生后,Wnt信号通路通常会被激活,因此,通过抑制Wnt信号通路的激活或可成为一种减轻或修复AMI所引起的心肌细胞损伤的有效策略[8-9]。

MiRNA是一类非编码短链RNA,多种miRNA在心肌细胞的损伤中及AMI的治疗中发挥着重要作用[10-11]。MAYORGA等[12]研究表明Wnt/β-catenin信号通路及miRNA-145参与AMI发展的调节。SUN等[6]研究显示miRNA-154通过激活Wnt/β-catenin信号通路参与调节心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡。miRNA-34a通过调节Wnt/β-catenin信号通路的激活,调控AMI所引起的细胞凋亡[13]。作为miRNA家族的成员之一,miRNA-124-3p也在细胞的增殖与凋亡中发挥着作用[14-15]。BAI等[16]研究显示,CircHIPK3与miRNA-124-3p 结合可抑制心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞增殖能力和诱导凋亡,下调miRNA-124-3p可通过抑制心肌细胞凋亡而发挥对心肌梗死的保护作用[5]。然而,miRNA-124-3p的作用机制并不明确,在OGD条件下,抑制miRNA-124-3p与Wnt/β-catenin信号通路及细胞凋亡之间的关系,还未见报道。

本实验结果显示,利用OGD模型转染miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA至心肌细胞后,Wnt1 siRNA可有效敲低模型心肌细胞Wnt1与β-catenin的表达,而miRNA-124-3p抑制剂同样可有效敲低模型心肌细胞中Wnt1与β-catenin的表达,说明miRNA-124-3p对其有一定的调节作用;与OGD组细胞相比较 miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA可提高OGD组中心肌细胞的活性,且二者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

为了检测miRNA-124-3p抑制剂与Wnt1 siRNA在心肌细胞凋亡中的作用机制,本课题组利用Western blot 检测了各组细胞凋亡相关蛋白的表达,与正常对照组相比较,OGD组细胞中p53、Bcl-2蛋白的表达均明显降低,Bax及cleaved-caspase-3的表达明显升高;而与OGD组比较,miRNA-124-3p抑制剂组和Wnt-1 siRNA组细胞中p53、Bcl-2蛋白的表达明显升高,Bax及cleaved-caspase-3的表达明显降低,且两组p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白水平比较,差异无统计学意义(P<0.05),ELISA结果显示转染miRNA-124-3p抑制剂及Wnt1 siRNA后,细胞中TNF-α、IL-6及IL-1β水平均明显降低,且二者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。说明miRNA-124-3p抑制剂对OGD的心肌细胞有一定的保护作用。

综上所述,miRNA-124-3p抑制剂可通过抑制Wnt1与β-catenin的表达来抑制Wnt信号通路的激活,进一步抑制心肌细胞的凋亡,减轻细胞损伤,减少炎性因子的释放,对OGD的心肌细胞起到保护作用。可为临床心肌细胞缺血缺氧的治疗提供参考。

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