重症急性胰腺炎大鼠CARD9的早期表达及柴芩承气汤的干预研究*

门昌君，张平平，刘 钰，张国梁△，王东强

(1.天津市第一中心医院消化科，天津 300192；2.天津市第一中心医院中西医结合科，天津 300192；3.天津医科大学，天津 300070)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一种以胰腺自身消化、坏死为主要特征引起的消化道组织水肿、胃肠道蠕动功能减退、黏膜屏障功能受损，并可引起全身炎性反应或导致多器官功能障碍的一种临床综合征[1]。因其病情进展快速、病死率高达30%～40%、预后差，易出现多器官衰竭(multiple organs dysfunction syndrome,MODS)，是临床上常见的危重急腹症[2]，并有近20%的急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)被诊断为SAP[3]。SAP发生后多种炎症细胞被激活，释放出白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-10及其他炎性因子并启动全身炎性反应，导致胰腺组织细胞凋亡即“炎性介质瀑布样级联效应”[4-5]。因此，在SAP早期控制炎性反应和细胞凋亡，是提高患者的生存率和改善预后的重中之重。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)是在巨噬细胞内高表达的一种新型蛋白，作为多数受体路径的载体，可以激活多种炎性反应信号传递路径，促进炎性因子的生成。有研究发现，在早期AP患者外周血中，CARD9 mRNA表达明显增高，且磷酸化CARD9的表达水平与胰腺炎病情程度呈正相关[6]。柴芩承气汤是在中医“益活清下”治疗思想下加用活血化瘀、行气止痛化裁而成，以大黄、芒硝为主，辅以厚朴、黄芩、柴胡等中药。现代医学认为，该方剂能清除肠道生物屏障，能清除肠源性内毒素、抑制蛋白酶激活和肠道细菌移位，清除血浆和组织内炎性反应递质和氧自由基，阻断感染作用[7]。研究发现，柴芩承气汤作用于胆碱能通路上调巨噬细胞乙酰胆碱受体α7(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)的表达[8]，减少SAP炎性介质释放及胰腺的病理损害[9]。本研究重点检测SAP大鼠胰腺组织CARD9早期表达并探讨柴芩承气汤对病情的干预作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健康SD大鼠60只，体重220～280 g，雌雄不限，待其适应国家卫生健康委员会危重病急救医学重点实验室(天津市第一中心医院)的实验室条件生存1周。实验动物及其食用的标准饲料由天津医科大学实验动物中心提供，单笼饲养、自由饮食饮水，所有的实验操作均符合《中国动物研究协会》的所有规定。

1.2 方法

1.2.1动物模型制备

实验动物术前禁食12 h，称重后通过行腹腔内注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉。待全身麻醉后备皮，保持仰卧位。于剑下沿腹壁正中线开腹、暴露胃及十二指肠，确定十二指肠乳头位置，肝脏下垫无菌棉保护肝组织，于肝门处与小动脉夹暂时夹闭胆管，于十二指肠乳头开口插入1 mL注射器后将5%牛磺去氧胆酸钠(1.0 mL/kg)逆行进入胆胰管，注射速度约为0.2 mL/min。注射完毕待药液扩散2 min后松开小动脉夹、拔出注射器、取出肝下无菌棉关闭腹腔。大鼠苏醒后，可自由饮水、保持禁食的状态，直至出现大鼠胰腺组织水肿、出血或坏死等改变时提示建模成功，见图1。

A：开腹；B：夹闭肝门部胆管、保留胰胆管；C：逆行缓慢注入5%牛磺去氧胆酸钠；D：SAP模型胰腺。

1.2.2分组

将SD大鼠分为假手术组(SHAM组)、SAP组、柴芩承气汤组(CQCQD组)，每组20只。SAP大鼠建模完成3 h后，SHAM组于开腹后翻动胰腺数次后缝合腹壁；按照10 mL/kg予CQCQD组柴芩承气汤灌胃；SHAM组及SAP组均予生理盐水灌胃。

1.2.3标本采集及检测

(1)血清淀粉酶(AMY)：建模24 h后麻醉大鼠，经腹主动脉采血5 mL，离心后吸取上层透明血清标本分装标记，—80 ℃保存检测AMY。(2)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β：采用ELISA试剂盒检测血清TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4CARD9 mRNA表达水平检测

采用RNA提取试剂盒提取胰腺组织中的总RNA，以其为模板逆转录生成cDNA。再按照实时荧光定量PCR(qRT-PCR) SYBR Green法步骤进行PCR扩增，qPCR条件：95 ℃预变性3 min；PCR循环为95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,扩增40个循环周期。循环完毕后进行熔解曲线分析。每个标本设3个复孔，经过3次独立实验后得到的数据，采用2-ΔΔCt值计算CARD9 mRNA的表达水平。PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)，荧光定量PCR仪(LightCycler 96,瑞士罗氏公司)。CARD9上游引物：5′-ATT GAC CCC TCA CGA ATC AC-3′；下游引物5′-AGG AGC ACA CCC ACT TTC C-3′。内参U6上游引物：5′-TGC GGG TGC CTG CTT CGG CAG CAC-3′；下游引物：5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。

1.2.5计算病理评分

术后3、6和12 h分批处死大鼠，取部分胰腺组织置于—196 ℃液氮罐保存；剩余胰腺组织置入甲醛固定液中24 h后，予液体石蜡包埋后以2 μm连续切片进行苏木素-伊红(HE)染色观察病理学特征。从细胞水肿、炎性细胞浸润、出血和脂肪坏死4个方面进行综合评分。

1.2.6Western-blot法检测CARD9蛋白磷酸化水平

50 μg蛋白上样于10%聚丙烯酰胺凝胶上，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；半干法转印分离蛋白到聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜，1∶1 000一抗孵育PVDF膜，4 ℃过夜；二抗孵育PVDF膜1 h，ECL化学放光试剂发光显色。

1.2.7中药给药方剂及配制

方剂组成：金银藤30 g，蒲公英30 g，柴胡15 g，黄芩15 g，青香藤10 g，金铃子10 g，陈皮10 g，大黄10 g，芒硝10 g。根据《动物实验给药剂量折算公式》计算给药量，本研究中所用药材均为“江苏江阴天江药业有限公司”生产的配方颗粒剂(批号：1701136)。颗粒剂混合后，加入蒸馏水800 mL搅拌直至溶解；后分装为100 mL，于4 ℃冰箱保存，灌胃前给予37 ℃恒温水浴锅预热。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 AMP、TNF-α及IL-1β水平变化

SAP组AMP、IL-1β水平随造模时间延长而逐渐升高，TNF-α先升高后降低。与SHAM组比较，其炎性因子水平明显升高(P<0.05)。同时间点CQCQD组AMP、TNF-α及IL-1β水平较SAP组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 胰腺组织中CARD9 mRNA水平变化

SAP组CARD9 mRNA水平随着建模时间延长而逐渐升高。与SHAM组比较，SAP组CARD9 mRNA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。同时间点CQCQD组CARD9 mRNA较SAP组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平变化

续表1 各组AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平变化

2.3 胰腺组织病理及评分

SHAM组胰腺组织结构清晰，偶见红细胞及炎性细胞浸润，未见腺泡小叶受损及腺泡细胞坏死。SAP组腺泡细胞变性坏死增多，小叶结构破坏更为明显，炎性细胞及红细胞浸润增加，随建模时间延长，胰腺病理评分增高。CQCQD组3、6、12 h胰腺组织病理损伤和评分[(5.9±0.4)、(8.9±1.7)、(10.1±1.1)分]均较SAP组[(9.9±1.9)、(11.6±2.5)、(12.8±2.4)分]低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A：SHAM组；B：SAP组；C：CQCQD组。

2.4 胰腺组织中CARD9蛋白的磷酸化检测

以磷酸化CARD9条带与β-actin条带灰度值之比表示CARD9蛋白的磷酸化水平，在3、6及12 h时间点CQCQD组蛋白磷酸化水平较SAP组明显下降，较SHAM组有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a：P<0.05，与SHAM组比较；b：P<0.05，与SAP组比较。

2.5 TNF-α、IL-1β、病理评分及CARD9 mRNA表达的ROC曲线分析

TNF-α表达水平的AUC值为0.842(P<0.05)，灵敏度和特异度分别为78.4%、68.5%；IL-1β表达水平的AUC值为0.887(P<0.05)，灵敏度和特异度分别为88.4%、91.0%；病理评分的AUC值为0.888(P<0.05)，灵敏度和特异度分别为85.4%、92.2%；CARD9 mRNA表达的AUC值为0.923(P<0.05)，灵敏度和特异度分别为89.9%、94.8%。SAP大鼠模型CARD9 mRNA表达水平灵敏度、特异度及AUC值最高，有较高的诊断准确性，见图4。

图4 SAP大鼠模型ROC曲线

3 讨 论

CARD9是1个重要的衔接蛋白，属于包含CARD蛋白家族中的一员，定位于染色体9q34.3，CARD9 cDNA全长2 108 bp。其能与巨噬细胞内2个含有CARD 结构域的蛋白B细胞淋巴瘤因子10(B-cell lymphoma factor10，BCL10)、黏膜相关组织淋巴瘤易位蛋白(mucosa associated tissue lymphoma translocating protein，Maltl)结合，形成CARD9/Bcl10/Maltl复合体(CARD9复合体)。有研究发现，CARD9主要参与固有免疫炎性反应，而巨噬细胞在固有免疫炎性反应中起重要作用[10]。已有研究表明，CARD9作为核因子-κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎症信号通路的上游分子，促进巨噬细胞产生和释放炎性因子，对激活巨噬细胞起到重要作用[11]。目前已经证实，NF-κB与p38-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是SAP发病机制中调节促炎细胞因子产生的两条主要通道[12-13]。本研究通过建立SAP大鼠模型，检测各组各时间点TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA表达水平的变化，得出CARD9 mRNA随建模时间延长的增高趋势及与SAP的严重程度呈正相关；同时，SAP组大鼠AMY、TNF-α、IL-1β水平及胰腺病理评分均明显升高且随建模时间延长逐渐增加，验证了CARD9等作为新靶标在SAP发病早期的标志性意义。

刘媛琪等[14]通过实验研究发现，大黄可降低内毒素的吸收，抑制TNF-α和IL-1β的表达，有解热、抗炎、镇痛、抑制胃酸和胰蛋白酶分泌等作用[15]。XUE等[16]研究发现黄芩苷作用于SAP 大鼠时，可抑制NF-κB活化，减少TNF-α、IL-6表达，改善肝脏损伤。相关研究表明黄芩与柴胡配伍具有良好的保肝作用[17-18]。厚朴有抗病原微生物作用，芒硝可促进肠内毒素的排泄，枳实水煎液可促进胃肠蠕动。柴芩承气汤可排除胃肠积滞、清除肠道内的细菌和内毒素，保护肠道的机械和免疫屏障，减轻全身炎性反应，减少MODS发生及病程，从而降低病死率[19-20]。本课题组将柴芩承气汤引入动物实验的对比研究，结果发现：大鼠的胰腺损伤程度随建模时间延长逐渐加重，柴芩承气汤可有效改善SAP早期病情；随着病情进展胰腺组织中的CARD9 mRNA表达及磷酸化CARD9蛋白亦随之增加；CQCQD组大鼠胰腺组织中CARD9 mRNA表达及磷酸化CARD9蛋白明显低于同时间点的SAP组。本研究证实：柴芩承气汤不仅可以降低SAP模型大鼠血清淀粉酶水平及胰腺病理损伤，而且可以降低血清CARD9 mRNA、TNF-α及IL-1β水平。提示SAP血清促炎因子升高可能与巨噬细胞存在CARD9 mRNA表达上调有关；早期给予SAP模型大鼠柴芩承气汤可降低其血清TNF-α及IL-1β水平，可能是其下调巨噬细胞内质网CARD9 mRNA表达，抑制信号传导及炎性因子的释放，从而减轻SAP时胰腺减轻胰腺的病理损伤。

综上所述，本研究首次将ROC曲线引入大鼠SAP模型的研究，通过ROC曲线分析发现SAP大鼠模型CARD9 mRNA表达水平较TNF-α、IL-1β、病理评分的灵敏度、特异度及AUC值高，提示有较高的诊断准确性，可以将其作为评估SAP病情的新靶标。但由于本研究样本量有限，大鼠的个体性差异可能对实验结果有影响。此外，课题组应同时制备多个脏器的病理切片来观察柴芩承气汤对多器官的保护作用。今后还应继续收集临床病例，进行大样本量、多中心临床实验研究对动物实验成果进行验证。