丁酸钠联合X 射线照射对肺癌A549 细胞增殖的抑制作用及其对细胞周期的影响

李官虎, 郎庆旭, 刘纯岩, 刘 沁, 耿梦柔, 李晓倩, 王珍琦

（1. 吉林大学公共卫生学院 国家卫健委放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021；2. 吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春130041）

近年来，我国肺癌发病率逐年升高。肺癌在所有癌症中死亡率排第1 位［1］，平均5 年存活率约为18%，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 占85%，多数患者确诊时难以手术切除，其治疗主要依靠化疗与放疗相结合。近十几年来，尽管放疗技术和全身治疗取得很大进展，但在NSCLC 治疗方面仍然收效甚微。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）可以抑制组蛋白的乙酰化，使染色质结构松散，从而改变基因表达，抑制细胞生长，通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡来改变细胞应答［2-5］。因此，近年来HDACi 作为一种新的抗癌药物受到重视，超过28 种HDACi 正在研究过程中［6］。研 究［7］表 明：第2 代HDACi Quisinostat（JNJ-26481585）治疗NSCLC 取得较好的效果，提示 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 （histone deacetyl transferases，HADC） 和HDACi 可 为NSCLC 提供新的治疗策略。然而，癌细胞对HDACi 的抗性常常限制了其应用［8-9］。为了提高HDACi 治疗癌症的疗效，目前已研究出多种治疗方法的组合。在体内外实验中，已经证明HDACi 与其他抗癌药物可以在NSCLC 中产生协同或加成效应［10-14］。有研究［15-16］报 道： HDACi 可 以 抑 制 同 源 重 组（homologous recombination，HR） 相关基因表达，为其辐射增敏作用提供了理论依据，但其具体机制尚需进一步探讨。

丁酸钠（sodium butyrate，NaBt）是第一个被发现的HDAC 非特异性抑制剂，是常用的Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDACi［17］，与其他抑制剂比较，其对HDAC的抑制效果更明显，可抑制结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和白血病等多种肿瘤细胞的生长，诱导其分化，使肿瘤细胞表现出类似正常细胞的行为，同时诱导细胞凋亡，抑制肿瘤的侵袭和浸润，影响细胞周期调控等［18］，但其是否具有放射增敏作用及其分子机制尚未阐明。本研究通过检测NaBt 单独或联合X 射线照射对肺癌A549 细胞的增殖抑制作用及对细胞周期的影响，探讨NaBt 是否具有放射增敏作用，为NSCLC 的治疗提供新的策略和理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人NSCLC A549 细胞购自中国科学院上海细胞库，采用常规培养。培养条件：含10%胎牛血清的高糖DMEM，37℃、5%CO2和100%饱和湿度，细胞每3～4 d（即细胞密度在铺满皿底70%～80%时）传代1 次。NaBt（美国Sigma 公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美国Gibco 公司），胰蛋白酶（上海生物技术有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，美 国Solarbi 公 司），二 甲 基 亚 砜（DMSO，重庆东方试剂厂），CCK-8 试剂盒（美国Bimake 公司）。TDZ5 台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司），Pico&Fresco 台式离心机（德国Heraeus 公司），X 射线深部辐照仪（型号X-RAD 320 ix，德国PXI 公司），高压锅（日本Yamato 公司），GAX-9240 干燥箱（上海博讯公司），细胞培养箱（新加坡ESCO 科技有限公司），Epoch 酶标仪（美国BioTek 公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 CCK-8 法检测细胞增殖率将细胞接种于96 孔细胞培养板，每孔3×103个细胞，8 个复孔。细胞分为对照组、不同浓度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 组、4 Gy X 射线照射组和不同浓度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 联合4 Gy X 射线照射组，同时设空白组。使用X 射线深部辐照仪照射，照射条件：电压180 kV，电流20 mA，单次源靶距70 cm，剂量率1.0 Gy·min－1，照射时间4 min，照射剂量4 Gy。继续培养细胞24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法测定细胞活力，将每孔中的培养液吸出，加入100 μL 新鲜培养液，再向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续孵育3 h，用酶标仪在波长450 nm 处检测吸光度（A）值。按照以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率= （加药组A 值－空白组A 值）/（对照组A 值－空白组A 值）×100%。

1.3 流式细胞术检测不同细胞周期细胞百分率将处于对数生长期的细胞接种于6 孔细胞培养板中，分 为 对 照 组、 10 mmol·L－1NaBt 组、20 mmol·L－1NaBt 组、4 Gy X 射 线 照 射 组、10 mmol·L－1NaBt 联 合4 Gy X 射 线 照 射 组 和20 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组（加入10 和20 mmol·L－1NaBt 24 h 后给予4 Gy X 射线照射）。培养24 h 后收集细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液后，1 000 r·min－1离心5 min，弃上清，加入1 mL 预冷的PBS 缓冲液洗涤2 次，加10 mg·L－1RNA 酶50 μL 和5 mg·L－1碘 化 丙 啶（PI） 150 μL，4 ℃避光孵育30 min，用尼龙布过滤，流式细胞术检测不同细胞周期细胞百分率。采用CellQuest 软件收取细胞（每份样品收取1.0×104个细胞），采用ModFit 软件分析细胞周期，结果以细胞周期各时相细胞的百分率表示。

1.4 统计学分析采用SPSS 24.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖率和不同细胞周期细胞百分率均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖率不同浓度NaBt 单独作用A549 细胞24 h 后，细胞增殖率无明显变化；作用48 和72 h 后，与 对 照 组 比 较，5、15、20 和25 mmol·L－1NaBt 组细胞增殖率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈浓度和时间依赖性。

不同浓度NaBt 联合4 Gy X 射线照射作用A549细胞24 h 后，细胞增殖率略有所升高。联合作 用 48 h 后，与 对 照 组 比 较，15 、 20 和25 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率明显降低（P＜0.01）；与4 Gy X 射线照射组比较，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）；分 别 与15、20 和25 mmol·L－1NaBt 组 比较，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率均明显降低（P＜0.05）。联合作用72 h 后，与对照组比较，不同浓度NaBt 联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率明显降低（P＜0.01）；与4 Gy X 射线照射组比较，不同浓度NaBt联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率均明显降低（P＜0.01）；与相对应浓度NaBt 组比较，20 和25 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组细胞增殖率均明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 不同浓度NaBt 单独或联合4 Gy X 射线照射24、48 和72 h 后各组A549 细胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

表1 不同浓度NaBt 单独或联合4 Gy X 射线照射24、48 和72 h 后各组A549 细胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Proliferation rate（t/h）24 1.00±0.00 48 1.00±0.00 Control NaBt(mmol·L－1)5 10 15 20 25 4 Gy X-ray irradiation NaBt+4 Gy X-ray irradiation 5 mmol·L－1+4 Gy 10 mmol·L－1+4 Gy 15 mmol·L－1+4 Gy 20 mmol·L－1+4 Gy 25 mmol·L－1+4 Gy 0.95±0.33 0.98±0.32 0.98±0.28 1.00±0.03 0.96±0.04 1.02±0.01 72 1.00±0.00 0.95±0.01**0.98±0.01 0.96±0.01*0.95±0.01**0.91±0.02**0.98±0.01 0.61±0.01**0.51±0.04**0.58±0.02**0.62±0.01**0.53±0.03**0.96±0.05 0.61±0.03**##0.53±0.04**##0.55±0.03**##0.49±0.01**△△##0.39±0.02**△△##1.06±0.02*1.15±0.06*1.08±0.01**1.06±0.02**1.02±0.01 0.99±0.03 0.99±0.04 0.91±0.02**△##0.91±0.02**△#0.89±0.01**△##

2.2 各组不同细胞周期A549 细胞百分率NaBt单独或联合4 Gy X 射线照射作用24 h 后，与对照组比较，10 mmol·L－1NaBt 组G0/G1期细胞百分率明显升高（P＜0.01），S 期细胞百分率明显降低（P＜0.01）；20 mmol·L－1NaBt 组G0/G1期和G2+M 期细胞百分率均明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），S 期细胞 百 分 率 明 显 降 低（P＜0.01）；4 Gy X 射线照射组和10 mmol·L－1NaBt 联合4 Gy X 射线照射组G2+ M 期细胞百分率均明显升高（P＜0.01），G0/G1期和S 期细胞百分率均明显降低（P＜0.01）。见表2。

3 讨 论

随着医疗技术的不断创新发展，疾病的诊断与治疗手段日益提高，但是肺癌的发病率仍居高不下，5 年生存率维持在15%左右［19］。目前放射治疗是治疗肺癌的主要方法之一，NSCLC 的放射性治疗推荐剂量非常高，往往达到60～70 Gy，高剂量的放射治疗对癌细胞非常有效，也能够在一定程度上控制患者的病情［20］。但由于癌细胞的辐射抗性，治疗效果与预期相比仍有很大差距；同时，正常组织细胞对射线敏感，容易产生放射性肺纤维化和放射性炎症，严重影响了患者的生存质量。增加肿瘤细胞对放疗的敏感性无疑是提高疗效的重要手段［21］。在影响肿瘤发生发展的诸多因素中，表观遗传学的改变是新的研究热点。组蛋白修饰可以改变染色质的松散程度，也就增加了DNA 的暴露程度，表明组蛋白修饰成为放射增敏靶点的可能。

表2 不同浓度NaBt 单独或联合4 Gy X 射线照射作用24 h 后各组不同细胞周期A549 细胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

表2 不同浓度NaBt 单独或联合4 Gy X 射线照射作用24 h 后各组不同细胞周期A549 细胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

“－”：No data.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of A549 cells G0/G1 83.057 ± 0.071 G2 + M 2.060 ± 0.839 S Control NaBt(mmol·L－1)10 20 4 Gy X-ray irradiation 10 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 20 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 14.883±0.783 2.873±0.062**3.823±0.049**3.403±0.057**3.270±0.162**—93.203±0.482**88.890±0.538**69.103±0.501**64.133±0.904**—3.923±0.245 7.287±0.345*27.490±0.540**32.593±0.952**—

NaBt 是 第Ⅰ类HDACi。研 究［22］表 明：NaBt在体内外实验中具有抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡及分化的作用，且对机体有较低的细胞毒性。但其在肺癌中作用的研究尚未见报道。本研究结果显示：NaBt 可以抑制肺癌A549 细胞增殖，呈时间和浓度依赖性，NaBt 和电离辐射联合作用可增加A549 细胞的辐射敏感性，并且对细胞的增殖抑制更加明显，表明对细胞毒性作用加强；NaBt 诱导A549 细胞发生G0/G1期阻滞，使细胞停滞在DNA合成前期，从而抑制肿瘤细胞的增殖；而单纯电离辐射和NaBt 联合电离辐射则诱导A549 细胞发生G2+M 期阻滞，使细胞停滞在对辐射更为敏感的G2+M 期，表明NaBt 对A549 细胞具有增殖抑制作用，并呈浓度依赖性；NaBt 与电离辐射的联合作用效果明显优于NaBt 单独作用，对A549 细胞的抑制作用更强，而细胞周期的变化很可能是引起上述现象的因素之一，可能是NaBt 通过表观遗传的改变导致染色质结构的变化，进而引起的一系列变化，其详细机制尚需从细胞凋亡、细胞自噬、细胞周期和DNA 损伤修复等方面进行深入的研究。同时，在其他对HDACi 的研究中也得到了类似的结果［23］。RIVERA 等［24］研究显示： HDACi 阿贝司他（abexinostat） 与射线联合应用对NSCLC 的体内外抗肿瘤作用增强。

另外，在本实验中，采用NaBt 作用24 h 后再给予4 Gy X 射线照射，而本课题组在前期实验中给药后立即给予X 射线照射，并未出现联合作用毒性作用的加强（结果未列出），表明表观遗传的改变需要一定的时间。

综上所述，在体外实验中，NaBt 对A549 细胞具有增殖抑制作用和放射增敏作用，并呈浓度和时间依赖性，NaBt 和X 射线的联合抑制效果明显优于二者单独应用，其机制可能是二者联合作用引起A549 细胞G2+M 期阻滞。NaBt 联合X 射线照射可提高NSCLC 患者治疗的有效性，为NSCLC 的治疗提供了新的方法。