海研站菌S52 菌株Cr(Ⅵ)还原酶活性和稳定性及其还原Cr(Ⅵ)的条件优化

李佳瑶, 李晓夏, 安秋颖, 范 春, 郭东北, 唐 晨, 张 敏, 桑都哈西·歇里亚孜旦, 赵 苒

（1. 厦门大学分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室 厦门大学公共卫生学院预防医学系，福建厦门 361102；2. 四川省成都市邛崃市卫生健康局办公室，四川 成都 611530）

铬（Chromium，Cr） 是导致环境污染的主要重金属元素之一，金属电镀、纺织染色和木材处理等工业生产活动中排放出来的污水中均含有Cr［1］。自然界中以三价铬［trivalent chromium，Cr（Ⅲ）］和六价铬［hexavalent chromium，Cr （Ⅵ）］最为稳定，但二者的性质大不相同。Cr（Ⅲ） 毒性较小，微量的Cr（Ⅲ）是机体必需的营养物质；Cr（Ⅵ）溶解度更高，具有强烈的致癌、致畸和致突变性，其毒性比Cr （Ⅲ） 高约100 倍，致突变性高1 000 倍［2］，美国环境环保局已经把Cr（Ⅵ）确定为对人体最具威胁的17 种化学物质之一［3］。人群主要通过食物、饮用水摄入和空气等途径暴露于Cr［4］，皮 肤 及 呼 吸 系 统 易 受 损 害［5］。由 于 食 物 链的生物富集和放大作用［6］，因重金属等化学污染物排放造成的海洋污染，已致海产品面临食品安全问题［7］。针对福建省水产品中Cr 蓄积情况的研究［8］显示：部分水产品样本存在Cr 超标的现象。流行病学调查［9］显示：长期职业暴露于Cr 也是肺癌高发的危险因素。因Cr（Ⅵ）污染而带来的公众健康问题日益突出，如何安全有效地去除或减少Cr（Ⅵ）污染，对保护生态平衡和人类健康具有重大意义。

Cr（Ⅵ）污染水体的主要治理方法有传统的物理化学方法和生物修复法。物理化学方法主要包括还原-离子交换法、吸附法和混凝法等，虽然处理效果尚可，但其存在反应过程复杂、成本高、副产物较多和易产生二次污染等不足［10］。生物修复法是一种新兴的、环境友好型的Cr（Ⅵ）污染水体修复技术，主要包括动物修复法、植物修复法和微生物修复法，具有过程安全、成本低、修复效率高和无二次污染等优点，具有良好的发展前景［11］。pH 值和温度一直被认为是微生物修复Cr（Ⅵ）的2 个重要影响因素，可能影响着菌株内或者生物膜上有关蛋白酶的作用。pH 值和温度影响菌株还原效率的相关研究已多见报道［12-13］，但大多停留在对还原菌株的筛选及其还原效率层面，鲜见对菌株胞内胞外活性物质分析及其最优还原条件探索的研究。

本课题组前期从厦门市大嶝岛双沪码头附近的海滩沉积物样品中成功分离筛选获得一株具有高效Cr（Ⅵ）还原能力的细菌Mesonia sp.S52，将其命名 为 海 研 站 菌 S52 菌 株 （ 授 权 专 利 号：ZL201410819468.3）。在实验室条件下，该菌株最大 耐Cr （Ⅵ） 浓 度 为500 mg·L－1，48 h 内 对50 mg·L－1Cr（Ⅵ） 的还原率可达73%以上。本研究通过对S52 菌株还原活性物质［Cr（Ⅵ）还原酶］ 进行提取和定位，同时探讨pH 值和温度对Cr （Ⅵ）还原酶稳定性和活性的影响，以及不同金属离子和小分子物质对其还原效率的影响，旨在明确S52 菌株还原Cr（Ⅵ）的途径及其机制，为后续微生物修复技术的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、主要试剂和仪器

选用的实验菌株来源于本实验室从厦门市大嶝岛双沪码头附近的海滩沉积物样品中分离筛选并进行鉴定得到的海研站菌（Mesonia sp.） S52 菌株。LB 肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司），重铬酸钾、Triton X-100、 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、丙酮、 吐温80 和十二烷基硫酸钠（SDS） 等化学试剂均为分析纯。U410-86 型超低温冰箱（美国NBS 公司），Epoch2 型全波长酶标仪（美国Biotek 仪器有限公司），KQ3200B 型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司），THZ-C 型恒温振荡器（江苏太仓强乐实验设备有限公司），EL204 型电子天平和FE20 型pH 计（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），DNP-9052 型恒温培养箱（厦门精艺兴业科技有限公司），VCX130PB 型超声波破碎仪（美国Sonics 公司），SW-CJ-2F 型超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司），MSH-S 型磁力搅拌器［大龙兴创实验仪器（北京）有限公司］，GI54TW 型全自动灭菌锅［致微（厦门）仪器有限公司］，湘仪GL-21M 离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 种子液的制备

取保存于－80 ℃超低温冰箱中的S52 菌液，平板划线法接种于LB 固体培养基中，挑取分离纯化得到的S52 单菌落于LB 液体培养基中，37 ℃、160 r·min－1恒温摇床培养12 h 即得S52 种子液。

1.3 Cr（Ⅵ）还原酶的提取和定位

按4%接种量将S52 种子液接种于LB 液体培养基，过夜培养（12 h）后，4 ℃、12 000 r·min－1离心5min，经0.22 μm 滤膜过滤后，收集上清液即为胞外活性物质（胞外酶）；用Tris-HCl 缓冲液（pH 值为8.0）洗涤菌体，再次离心去上清，重复3 次，加入原培养基的1/20 体积的Tris-HCl，漩涡振荡，转移到无菌玻璃容器中，用超声波破碎仪冰浴 破 菌，将 破 碎 液4 ℃、12 000 r·min－1离 心20 min，取上清液到新的离心管中，即为胞内活性物质（胞内酶）［13-14］。将上述获得的胞内活性物质用Tris-HCl 定容至与胞外活性物质的体积相同，与用作对照组的S52 全菌体分别加入到含50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的培养体系中，37 ℃、pH 值为8.0、160 r·min－1摇 床 培 养，于0、3、6、12、24 和48 h 分别采用二苯碳酰二肼分光光度法分别测定溶液中Cr（Ⅵ）浓度，计算不同时刻Cr（Ⅵ）还原率。Cr （Ⅵ） 还原率计算方法：实验初始Cr （Ⅵ）浓度记为ρ0，待测时点测得Cr（Ⅵ）浓度 记 为ρ1，待 测 时 刻 还 原 率X= （ρ0-ρ1）/ρ0×100%，根据计算所得的Cr （Ⅵ） 还原率判断Cr （Ⅵ）的还原情况。

1.4 Cr（Ⅵ）还原酶的性质

1.4.1 不同温度和不同pH 值时Cr（Ⅵ）还原酶活性 37 ℃、pH 值为7.0 条件下，将一定量的Cr （Ⅵ）还原酶（即胞外、胞内活性物质） 与50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，3 h 后测定Cr（Ⅵ）浓度，将Cr（Ⅵ）浓度的减少量作为活性测定的标准［15］，以相对活性指标来表示Cr（Ⅵ）还原酶活性，相对活性=不同条件下Cr（Ⅵ）浓度减少量/前述相对活性的标准×100%。保持pH 值7.0 不变，改变温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃；在酶 活 性 最 高 的37 ℃下，改 变pH 值 为5.0、6.0、8.0、9.0 和10.0，分 别 与50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，同样计算得出Cr（Ⅵ）还原酶相对活性。

1.4.2 不同温度和不同pH 值时Cr（Ⅵ）还原酶稳定性 将一定量Cr（Ⅵ）还原酶置于4 ℃、pH 值为7.0 的LB 培养基中24 h 后取出，在pH 值7.0、37 ℃条件下与50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反应，3 h 后测定Cr（Ⅵ）浓度，将Cr（Ⅵ）浓度的减少量作为相对稳定性的标准［15］，以相对稳定性指标来表示Cr（Ⅵ）还原酶稳定性，相对稳定性=不同条件下Cr（Ⅵ） 浓度减少量/前述相对稳定性的标准×100%。保持pH 值7.0 不变，改变温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃；4 ℃条件下将pH 值分别改为5.0、 6.0、 8.0、 9.0 和10.0，24 h 后 分 别 与50 mg·L－1Cr （Ⅵ） 在37 ℃条件下反应，同样计算得出Cr（Ⅵ）还原酶相对稳定性。

1.5 二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度

参照《生活饮用水标准检测方法金属指标》（GBT 5750.6-2006），测定Cr（Ⅵ）浓度。

1.6 二苯碳酰二肼分光光度法测定不同温度和不同pH 值组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率

将温度设为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃，pH 值设为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0。采用混合实验设计，将各个温度水平与pH 值水平完全随机组合（6×6），实验组总共设为36 组，同时各设3 组平行对照。分别以4%接种量接种S52 种子液于含50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的培养基中，不同温度和不同pH 值条件下，同时置于160 r·min－1恒 温 摇 床 中 震 荡 培 养，在0、3、6 和12 h 分别采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr （Ⅵ）浓度并计算各个时刻的Cr（Ⅵ）还原率。采用方差分析和多重比较等统计学方法，分析S52 菌株的Cr（Ⅵ）还原酶还原Cr（Ⅵ）的最适宜温度和pH 值，拟合出最优还原条件。

1.7 二苯碳酰二肼分光光度法测定不同金属离子处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率

分别将浓度为0.2 mmol·L－1的Cu2+、Mn2+和Cd2+溶液加入到LB 液体培养基中作为处理组，以未作处理的培养基作为对照组，在“1.6”中得到的最优还原条件下与50 mg·L－1的Cr （Ⅵ） 反应3 h，采用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度，比较不同金属离子处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率。

1.8 二苯碳酰二肼分光光度法测定不同小分子物质处理组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率

分别将浓度为1 mmol·L－1的SDS、EDTA 和1%的Triton100、吐温80 加入到LB 液体培养基中作为处理组，以未做处理的培养基作为对照组，在“1.6”中得到的最优还原条件下与50 mg·L－1的Cr （Ⅵ）反应3 h，用二苯碳酰二肼分光光度法测定Cr（Ⅵ）浓度，比较不同小分子物质处理组Cr （Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，应用Excel 2018 软件绘制图表。Cr （Ⅵ） 还原酶对Cr （Ⅵ）的还原率、Cr（Ⅵ）还原酶相对活性和相对稳定性均符合正态分布并且方差齐，以表示，不同温度和不同pH 值处理组间比较采用析因方差分析和多重比较，不同金属离子和小分子物质处理组多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Cr（Ⅵ）还原酶的提取和定位

随着时间延长，S52 原菌体对Cr（Ⅵ）的还原率不断升高，48 h 时对50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的还原率可达73.1%； 3 h 时，胞 内 酶 和 胞 外 酶 对Cr （Ⅵ）的还原率达到最高，且胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率高于胞外酶（P＜0.05）；随后Cr（Ⅵ）还原率不断降低，相同时间点胞内酶和胞外酶的对Cr（Ⅵ） 的还原率比较差异无统计学意义（P＞0.05），但与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），12 h 后Cr（Ⅵ）还原率几乎为0，且12、24 和48 h 间Cr（Ⅵ）还原率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 Cr（Ⅵ）还原酶的性质

2.2.1 不同温度时胞内酶和胞外酶的相对活性和稳定性 对于胞内酶，保持良好活性的温度范围为35 ℃～45 ℃，若将其预先置于45 ℃～50 ℃条件下24 h 可能会引起酶的不稳定，同时影响酶活性（图1 A）；对于胞外酶，在25 ℃～30 ℃时较适合其酶活性发挥，4 ℃～30 ℃稳定性较好，且不同温度间差别不明显（图1 B）。因此胞内酶最适温度为35 ℃～45 ℃，胞外酶最适温度为25 ℃～30 ℃。

表1 不同时间点S52 菌株胞内酶和胞外酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab.1 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular and extracellular enzymes in S52 strain at differenttime points

表1 不同时间点S52 菌株胞内酶和胞外酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab.1 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular and extracellular enzymes in S52 strain at differenttime points

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with extracellular enzyme.

Group Reduction rate of Cr(Ⅵ)48 73.1±4.3 0.6±0.1*0.0±0.0*(t/h) 3 1.8±0.5 18.1±1.3*△10.8±1.5*6 12 11.8±1.9 0.2±0.1*0.1±0.2*24 26.9±3.1 0.0±0.0*0.8±0.1*Control Intracellular enzyme Extracellular enzyme 6.1±1.2 3.2±0.9*2.7±0.5*

2.2.2 不同pH 值时胞内酶和胞外酶的相对活性和稳定性 当pH 值＜7.0 或pH 值＞7.0 时，胞内酶的酶活性或稳定性会有较大损失，因此胞内酶的最适pH 值为7.0；当pH 值在7.0～8.0 时，胞外酶的稳定性较好，但当pH 值＞7.0 时，酶活性有一定损失，因此胞外酶的最适pH 值也为7.0。见图2。

2.3 不同温度和不同pH 值条件下胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率

随着时间延长，不同温度和不同pH 值条件下胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率均逐渐降低，12 h 时所有组未见明显还原效果。作用3 h 时，相同温度下，pH 值从5.0 到6.0，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显升高；随着pH 值升高，其还原率大幅降低。在一定pH 值条件下，温度从25 ℃～45 ℃，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率逐渐升高。在45 ℃、pH 值6.0条件下，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率最高，达到39.7%。采用析因设计资料方差分析，不同pH 值组间胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率比较差异有统计学意义（F=201.748 ，P＜0.05）；结合多重比较，当pH 值为6 时，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率高于其他pH 值组（P＜0.05）；不同温度组间胞内酶对Cr（Ⅵ） 的还原率比较差异有统计学意义（F=44.671，P＜0.05），温度为40℃和45℃组胞内酶对Cr（Ⅵ） 的还原率均高于其他组（P＜0.05），但其2 组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。温度和pH 值具有明显的交互效应（P＜0.05）。见表2。

2.4 不同温度和不同pH 值条件下胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率

随着时间延长，不同温度和不同pH 值条件下胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率均逐渐降低，12 h 时所有组均未见明显还原效果。作用3 h 时，温度一定时，pH 值从5.0 到6.0，胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显升高；随着pH 值从7.0 增加到10.0，其还原率呈降低趋势。随着温度从30 ℃逐渐上升至50 ℃，胞外酶对Cr（Ⅵ） 还原率逐渐降低。在30 ℃、pH 值6.0 条件下，胞外酶还原率最高（19.8%）。采用析因设计资料方差分析，不同pH值组间胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率比较差异有统计学意义（F=580，P＜0.05）；结合多重比较，pH 值6.0 和7.0 组胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率均高于其他pH 值组（P＜0.05），但其2 组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；不同温度组间比较差异有统计学意义（F=355.064，P＜0.05），当温度为30 ℃时胞外酶时Cr（Ⅵ）的还原率高于其他温度组（P＜0.05）。温度和pH 值具有明显的交互效应（P＜0.05）。见表3。

图1 不同温度时胞内酶（A）和胞外酶（B）的相对活性和稳定性Fig. 1 Relative activities and stabilities of intracellular and extracellular enzymes at different temperatures

图2 不同pH 值时胞内酶（A）和胞外酶（B）的相对活性和稳定性Fig. 2 Relative activities and stabilities of intracellular and extracellular enzymes at different pH values

表2 不同温度和不同pH 值条件下作用3 h 胞内酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab.2 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular enzymes under conditions of different temperatures and pH values at 3 h after treatment

表2 不同温度和不同pH 值条件下作用3 h 胞内酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab.2 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular enzymes under conditions of different temperatures and pH values at 3 h after treatment

*P＜0.05 compared with pH 6.0 group at the same temperature；ΔP＜0.05 compared with 40 ℃at the same pH value；#P＜0.05 compared with 45 ℃at the same pH value.

pH Reduction rate of Cr(Ⅵ)50 10.0±1.1*Δ#33.4±3.3Δ#28.6±4.3*Δ#16.1±5.5*Δ#6.1±1.2*Δ#5.2±0.9*Δ#5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0(θ/℃)25 6.2±0.9*Δ#12.3±1.4Δ#12.3±1.9*Δ#7.4±0.4*Δ#5.8±1.1*Δ#3.4±0.1*Δ#30 7.9±1.1*Δ#24.5±2.1Δ#23.0±3.0*Δ#11.6±2.4*Δ#6.0±1.3*Δ#4.3±0.2*Δ#35 8.3±1.0*Δ#30.6±3.2Δ#29.2±2.3*Δ#17.4±3.6*Δ#8.0±1.5*Δ#5.8±0.8*Δ#40 12.9±1.8*38.2±3.3 33.6±4.1*19.2±3.5*9.1±3.0*6.8±0.9*45 14.4±4.0*39.7±4.2 36.0±5.1*19.9±1.9*9.3±1.1*7.1±0.8*

表3 不同温度和不同pH 值条件下作用3 h 胞外酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab.3 Reduction rates of Cr (Ⅵ)by extracellular enzymes at different temperatures and pH values at 3 h after treatment

2.5 不同金属离子作用3 h 后各组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率

在胞内酶和胞外酶最适条件下，与对照组比较，Cu2+处理组胞内酶和胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率明显升高（P＜0.05），而Cd2+和Mn2+处理组胞内酶和胞外酶对Cr （Ⅵ） 的还原率明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 不同金属离子作用3 h 后各组Cr(Ⅵ) 还原酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab. 4 Reduction rates of Cr(Ⅵ) by Cr(Ⅵ) reductases after treated with different metal ions for 3 h in various groups

2.6 不同小分子物质作用3 h 后各组Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原率

在胞内酶和胞外酶最适条件下，与对照组比较，Triton X-100 处理组胞内酶和胞外酶对Cr （Ⅵ）的还原率差异无统计学意义（P＞0.05），吐温80、EDTA 和SDS 处理组胞内酶和胞外酶对Cr （Ⅵ）的还原率均不同程度降低（P＜0.05）。见表5。

表5 不同小分子物质作用3 h 后各组Cr(Ⅵ)还原酶对Cr(Ⅵ)的还原率Tab. 5 Reduction rates of Cr(Ⅵ) by Cr(Ⅵ) redutases after treated with different small molecules for 3 h in various groups

3 讨 论

微生物对Cr（Ⅵ） 的还原通常包含胞内还原和胞外还原［16］，催化该过程的还原酶可能位于胞内、胞外和胞膜上［17］。本实验结果显示：S52 菌株的细胞内、外均有可能是还原酶还原Cr（Ⅵ）的场所。在pH 值为6.0、温度45 ℃的条件下反应3 h，胞内酶对Cr（Ⅵ）的还原率最高（39.7%），在pH 6.0、温度30 ℃的条件下反应3 h，胞外酶对Cr（Ⅵ）的还原率最高（19.8%），之后逐渐降低，均明显低于S52 全菌的最高还原率（73.1%），故推测除还原酶外，菌株S52 可能还存在使Cr（Ⅵ）还原的其他途径。酶作为菌株实现其还原功能的最主要单元，理论上其还原效率应近似于全菌，本课题组前期研究的Sporosarcina saromensisM52 菌株［14］，虽然其胞外活性物质的还原率远低于全菌，但其胞内活性物质的还原率约为全菌的1.3 倍。推测本研究中，在反应初期，大量的Cr（Ⅵ）进入菌体内，受相关活性物质催化，在未被还原为Cr（Ⅲ）之前，经电子传递系统形成了不稳定的中间体Cr（Ⅴ）［18］；随着还原反应继续，一部分Cr（Ⅴ）氧化为Cr（Ⅵ），形成大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使得胞内氧化压力增加，破坏细胞成分，影响核酸和氨基酸等的合成［19］，并导致遗传物质及蛋白质出现氧化损伤［20］。多数微生物在进化过程中形成了应对氧化压力的保护机制，产生能够与Cr（Ⅴ）鳌合形成相对 稳 定 的 去 铁 胺（deferoxamine，DFX） 类 物质［21］，但DFX-Cr（Ⅴ）螯合物只能暂时稳定存在，逐渐解离后，Cr（Ⅴ）会被快速氧化为Cr（Ⅵ），DFX 则被排出胞外。该机制可能是S52 菌株胞内和胞外还原率先升高后降低的原因。此外，本实验所提取的活性物质以离体形式存在，其还原体系中的电子供体总量有限，缺乏持续供能的活性物质及ATP 等，可能也是导致反应无法持续进行及后续还原率降低的原因之一。

本研究对S52 菌株胞内酶和胞外酶的相对活性和稳定性测定以及还原条件优化，结果显示：胞内酶还原Cr（Ⅵ）的最适温度为35 ℃～45 ℃，最适pH 值为7.0，胞外酶还原Cr（Ⅵ）的最适温度为25 ℃～30 ℃，最适pH 值为 7.0；从 二 者 还 原Cr（Ⅵ） 的最适温度范围未出现重合这一点来推测，S52 全菌发挥还原作用的温度范围可能较大。研究［22-24］显示：不同来源菌株的还原酶其性质存在一定的差别，如Bacillus sp．、Escherichia coliATCC 33456 和Bacillus thuringiensisC-2 菌 中 的 还原酶最适pH 值、温度以及相对活性、相对稳定性等最优还原条件均不完全相同。

魏斐等［24］研究发现：Cu2+能够明显促进苏云金芽孢杆菌对Cr（Ⅵ）的还原作用；肖伟等［15］和杨胜男等［25］的研究也证实Cu2+可增强Cr（Ⅵ）还原酶活性。 Cu2+参与构成多种抗氧化酶［26］，是很多还原酶的辅基［15］，还是氧化呼吸电子转运的重要部分［27］，上述功能有助于通过提高电子转移效率而提高Cr（Ⅵ）的生物还原［28］；除Cu2+外，其他重金属离子绝大多数在不同程度上抑制Cr（Ⅵ）还原酶的活性。本研究结果显示：Cd2+和Mn2+可抑制S52 菌株Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原。本研究结果同时显示：Triton X-100 对Cr（Ⅵ）还原酶还原Cr（Ⅵ） 无明显影响，吐温80、EDTA和SDS 则不同程度抑制Cr（Ⅵ）还原酶的活性，与魏斐等［24］研究结果基本一致，与郭东北等［14］研究结果略有不同，其研究显示Triton X-100 可以抑制Cr（Ⅵ）还原酶对Cr（Ⅵ）的还原。

在应用微生物修复水体Cr（Ⅵ）污染的实践中，污染水源中其他金属离子和小分子物质的存在可能会影响Cr（Ⅵ）的预期还原效果，故可通过加入经济、有效的促还原物质提升修复效果。另有研究［25，29-30］将菌藻共生体系用于修复含Cr（Ⅵ）和苯酚等的废水，结果显示：菌藻体系的还原效果高于单一菌株，提示不同细菌对污染物的去除可能存在协同作用，并因菌类和藻类的混合比例不同而表现出不同的修复效果，为进一步优化微生物修复效果提供了新的研究思路。

综上所述，微生物之所以能够在高浓度Cr（Ⅵ）的环境下生存，可能源于其存在特定的基因（簇），也可能由于不同浓度的Cr（Ⅵ）诱导微生物的相关功能基因发生变化，进化出对Cr（Ⅵ）的抗性和还原机制［31］。本研究通过对S52 菌株的Cr（Ⅵ）还原酶进行定位，初步探讨影响其还原效率的因素并进行优化，为阐明S52 菌株Cr（Ⅵ）还原酶还原Cr（Ⅵ）的分子生物学机制及其后续应用奠定了基础。